組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析
Summary
miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA 治療細胞周期と血管新生を阻止の活動を識別するために使用されます。
Abstract
肺がん (LC) は、世界中の癌関連死亡の主要な原因です。他の癌細胞と同様に、液晶セルの基本的な特徴は、無秩序な増殖と細胞分裂です。細胞周期の進行の停止によって増殖抑制は、LC を含むがん治療の有望なアプローチをする示されています。
miRNA 治療重要な転写後遺伝子調節因子として浮上しているし、ますますがん治療で使用するために検討されています。近作では、ミール 143 とミール-506、細胞周期の進行を調節する 2 つの Mirna を利用しました。A549 非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞をトランスフェクションした、遺伝子発現を解析していた、治療によるアポトーシスの活動を最後に行った。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のダウンレギュレーションが検出された (すなわち、CDK1、CDK4、CDK6) 細胞周期を G1 ・ S ・ G2/M 相転移で停止し、。経路分析では、潜在的な抗血管新生治療のアプローチを多面的な活動に寄与する活動を示した。ここでは、血管新生の阻害によって細胞周期抑制、アポトーシスの誘導、治療の血管内皮細胞に対する影響についての miRNA の活動を識別するために使用する方法論が説明されます。ここに提示されたメソッドが miRNA 治療と対応するアクティビティに関する今後の研究をサポートすることと、代表的なデータが解析中に他の研究者を導くことが望まれます。
Introduction
細胞周期は DNA ・細胞増殖分裂プロセス1の重複を許可する複数の規制イベントの組み合わせです。サイクリン依存性キナーゼ (Cdk) を調節する細胞周期2を推進しています。その中で、分裂 CDK (CDK1) と中間期 Cdk (CDK2、CDK4, CDK6) 細胞周期進行3で極めて重要な役割があります。網膜芽細胞腫タンパク質 (Rb) は、CDK4/CDK6 複雑な細胞周期進行4を許可するによりリン酸化され、CDK1 活性化5正常な細胞分裂に不可欠です。多数の CDK 阻害剤を開発し、がん治療における Cdk をターゲットの可能性を示す最後の数十年間、臨床試験で評価。乳癌の治療のため 3 CDK 阻害剤が承認されている実際には、最近6,7,8、の9,10。したがって、Cdk、とくに CDK1 と CDK4/6 は癌細胞の進行を調節するのには大きな関心と。
Mirna (miRs)、小さい、非コーディングの Rna とすべてのヒトの遺伝子11の約 30% を調節する遺伝子発現の転写後レギュレータ。彼らの活動は、翻訳抑制またはメッセンジャー Rna (Mrna)12の分解に基づいています。以上 5,000 Mirna が同定されているその生物学的意義の説明と単一の miRNA の分子は複数遺伝子11,13を調整できます。もっと重大に、miRNA の表現は様々 な疾患やがん13を含む病気の状態に関連付けられています。実際には、miRNAs 発癌性として特徴づけられているまたは腫瘍抑制、腫瘍の開発そして進行の14,のための15を抑制または促進することができます。罹病組織における Mirna の相対式は、病気の進行を調節することがしたがって、miRNAs の外因性の配信には、治療の可能性があります。
肺癌は、癌関連死の主要な原因よりすべての肺悪性腫瘍の 60% が非小細胞肺がん16,1720% 未満の 5 年生存率は18。ミール-143-3 p とミール-506-3 p の使用は肺がん細胞11で細胞周期をターゲットに最近行った。ミール 143 とミール 506 CDK1 と CDK4/CDK6、相補性は、シーケンス、A549 細胞に対するこれら 2 つ miRs の影響を分析しました。実験の詳細を提示し、本稿で説明。遺伝子発現、細胞周期の進行、およびアポトーシスは、さまざまな実験的デザインと縦長の次のトランスフェクションを用いて評価しました。我々 は特定の遺伝子発現を測定するマイクロ アレイ解析と共にリアルタイム定量 PCR (RT qPCR) を使用し、次世代 RNA シーケンスは遺伝子調節不全11を決定に使用されました。後者の方法は、たくさんの遺伝子は 1 つの実験的解析から解明できる、高い感度と再現性、各遺伝子の転写の相対的な豊かさを識別します。また、miRNA によるアポトーシス分析を行った、ここに記載されています。バイオインフォマティクスは、パスウェイ解析を補った。ここに示すプロトコル、組合せミール 143 の潜在的なミール 506 治療上の分析のために使用されます。
このプロトコルの主な目的は、細胞周期にフォーカスを持つセルの miRNAs の影響を特定します。さまざまなテクニックは紹介前訳語 (qPCR) 詳しく説明して新規の遺伝子発現解析からスパン マイクロ アレイ解析など、タンパク質レベルで遺伝子分析技術。このレポートは、miRNAs と働くことに興味を持って研究に役立つことが期待されます。さらに、細胞周期のフローサイトメトリー解析と細胞のアポトーシスの方法論を提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
Mirna の発現レベルの破綻を認識し、がん治療の標的治療として動作正常組織対病気にかかった。この研究の目的は潜在的に複数の段階の細胞周期の進行を止める Mirna を決定します。ミール 143 とミール 506 がこの組合せ miRNA 治療の活動を理解することを目的と示されたプロトコルや、がん細胞の細胞周期を停止が確認されました。
説明の方法論は、Mirna の機能の包括的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
利害の対立が宣言されていません。
Materials
| -80 °C Freezer | VWR | VWR40086A | |
| 96 well plate | CELLTREAT Scientific | 50-607-511 | |
| 96-well Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Agarose | VWR | 0710-25G | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938c | |
| Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA | Ambion | AM4611 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions | Full Moon Bio | KAS02 | |
| Bright field microscope | Microscoptics | IV-900 | |
| Bright field microscope | New Star Environment LLC | ||
| Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides | Full Moon Bio | ACC058 | |
| Cell Logic+ Biosafety Cabinate | Labconco | 342391100 | |
| Cellquest Pro | BD bioscience | Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle phase and for calculating the population distribution for the analysis of apoptosis | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | CFX96 Optics Module | |
| Chemidoc Touch Imaging System | BioRad | Chemidoc Touch Imaging System | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | HERAcell 150i | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Trevigen | 3433-010-01 | |
| Digital Camera | AmScope | FMA050 | |
| DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine | VWR | VWRL0100-0500 | |
| DNAse I | Zymo Research | E1010 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Biosciences | 356006 | |
| Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets | Eppendrof | 05-403-152 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, | Fisher BioReagents | BP2818500 | |
| Ethidium bromide | Alfa acar | L07462 | |
| F-12K Nutrient Mixture (Kaighn's Mod.) with L-glutamine, Corning | Corning | 45000-354 | |
| FACS Calibur Flowcytometer | Becton Dickinson | ||
| Fetal Bovine Serum – Premium | Antlanta Biologicals | S11150 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 10438026 | |
| Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps | Fisherbrand Basix | 02-682-002 | |
| Forma Series II water Jacket CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Heparin Solution (5000 U/mL) | Hospira | NDC#63739-920-11 | |
| Horixontal Electrophoresis system | Benchtop lab system | BT102 | |
| hsa-miR-143-3p miRNA Mimic | ABM | MCH01315 | |
| hsa-miR-506-3p miRNA Mimic | ABM | MCH02824 | |
| Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) | Thermo Scientific | PHC9394 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Individual donors | IRB# A15-3891 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | Results: Used for bioinformatics pathway analysis | |
| Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10-977-015 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11-668-027 | |
| Loading dye 10X | ward's science+ | 470024-814 | |
| Medium M199 (with Earle′s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate) | Sigma Aldrich | M4530 | |
| Microscope Digital Camera | AmScope | MU130 | |
| Modfit LT | Verity Software | Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | NanoDrop one C | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 31985-070 | |
| Penicillin-streptomycin 10/10 | Antlanta Biologicals | B21210 | |
| Power UP sybr green master mix | Applied Biosystems | A25780 | |
| Propidium Iodide | MP Biochemicals LLC | IC19545825 | |
| Proscanarray HT Microarray scanner | Perkin elmer | ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm. | |
| q PCR optical adhesive cover | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Quick-RNA Kits | Zymo Research | R1055 | |
| Ribonuclease A from Bovine pancreas | Sigma | R6513-50MG | |
| ScanArray Express | PerkinElmer | Step 7.33: Microarray analysis software | |
| Shaker | Thermo Scientific | 2314 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | ||
| SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml | VWR | 470224-998 | |
| SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml | VWR | 470225-004 | |
| TBS Buffer, 20x liquid | VWR | 10791-796 | |
| Temperature controlled centrifuge matchine | Thermo Scientific | ST16R | |
| Temperature controlled micro centrifuge matchine | Eppendrof | 5415R | |
| Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 12-556-009 | |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Thermo Scientific | PI23225 | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Thermo Scientific | PI89900 | |
| Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates | Thermo Scientific | AB0800WL | |
| Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs) | Thermo Scientific | AB1453B | |
| Ultra Low Range DNA Ladder | Invitrogen | 10597012 | |
| VWR standard solid door laboratory refrigerator | VWR |
References
- Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
- Barnum, K. J., O’Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nature Reviews Cancer. 9 (3), 153-166 (2009).
- Chen, Z., et al. Multiple CDK inhibitor dinaciclib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting CDK2 and CDK9 activity. Science Repository. 6, 29090 (2016).
- Brown, N. R., et al. CDK1 structures reveal conserved and unique features of the essential cell cycle CDK. Nature Communications. 6, 6769 (2015).
- Sanchez-Martinez, C., Gelbert, L. M., Lallena, M. J., de Dios, A. Cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors as anticancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (17), 3420-3435 (2015).
- Shah, A., et al. FDA Approval: Ribociclib for the Treatment of Postmenopausal Women with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Advanced or Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Asghar, U., Witkiewicz, A. K., Turner, N. C., Knudsen, E. S. The history and future of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (2), 130-146 (2015).
- Mullard, A. FDA approves Novartis’s CDK4/6 inhibitor. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (4), 229 (2017).
- Walker, A. J., et al. FDA Approval of Palbociclib in Combination with Fulvestrant for the Treatment of Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer. Clinical Cancer Research. 22 (20), 4968-4972 (2016).
- Hossian, A., Sajib, M. S., Tullar, P. E., Mikelis, C. M., Mattheolabakis, G. Multipronged activity of combinatorial miR-143 and miR-506 inhibits Lung Cancer cell cycle progression and angiogenesis in vitro. Science Repository. 8 (1), 10495 (2018).
- Inamura, K., Ishikawa, Y. MicroRNA In Lung Cancer: Novel Biomarkers and Potential Tools for Treatment. Journal of Clinical Medicine. 5 (3), (2016).
- Mizuno, K., et al. The microRNA expression signature of small cell lung cancer: tumor suppressors of miR-27a-5p and miR-34b-3p and their targeted oncogenes. Journal of Human Genetics. 62 (7), 671-678 (2017).
- Zhang, B., Pan, X., Cobb, G. P., Anderson, T. A. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. 발생학. 302 (1), 1-12 (2007).
- Peng, Y., Croce, C. M. The role of MicroRNAs in human cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1, 15004 (2016).
- Wang, X., et al. Prediction of recurrence in early stage non-small cell lung cancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images. Science Repository. 7 (1), 13543 (2017).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. . Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Saxon, J. A., et al. p52 expression enhances lung cancer progression. Science Repository. 8 (1), 6078 (2018).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer for ImageJ. ImageJ User and Developer Conference. , (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
- Kong, D. H., Kim, M. R., Jang, J. H., Na, H. J., Lee, S. A Review of Anti-Angiogenic Targets for Monoclonal Antibody Cancer Therapy. International Journal of Molecular Science. 18 (8), (2017).
- Wong, P. P., Bodrug, N., Hodivala-Dilke, K. M. Exploring Novel Methods for Modulating Tumor Blood Vessels in Cancer Treatment. Current Biology. 26 (21), R1161-R1166 (2016).
- Evan, G. I., Brown, L., Whyte, M., Harrington, E. Apoptosis and the cell cycle. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 825-834 (1995).
- Haab, B. B., Dunham, M. J., Brown, P. O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology. 2 (2), RESEARCH0004 (2001).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Currrent Protocols in Protein Science. 27, 21 (2013).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Science Repository. 3, 1860 (2013).
