Summary

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Abstract

Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.

Introduction

La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory1. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche couramment utilisée, peut-être en raison de la simplicité de la technique et le concept, est la mesure de courants postsynaptiques excitateurs/inhibiteur miniature (mE / CISP) sous la tension de la pince configuration2,3, 4 , 5 , 6. MPSC individuels représente le flux d’ions à travers des récepteurs ionotropiques postsynaptique (par exemple les récepteurs AMPA et GABAA ) en réponse à la fixation de leurs respectifs neurotransmetteurs libérés de la terminaison présynaptique 7 . Parce que l’enregistrement est obtenu en présence de la voltage-dépendants Na+ canal bloqueur tétrodotoxine (TTX), la libération est indépendant du potentiel d’action et comporte normalement une seule Vésicule synaptique qui contient des neurotransmetteurs. Selon cette hypothèse, l’amplitude moyenne du MPSC est employé couramment comme une estimation brute pour la taille quantique, qui représente le nombre et la fonctionnalité de récepteurs post-synaptiques s’opposant à un site de sortie du single. En revanche, la fréquence de la MPSC est considéré comme une combinaison du nombre de synapses se terminant sur la cellule postsynaptique et leur probabilité de sortie moyenne. Cependant, ces paramètres ne mesurent pas une autre variable-multiplicativity des synapses ou multiplicité synaptique — qui est important pour l’efficacité de la transmission synaptique.

Basé sur la théorie quantique de la transmission synaptique7,8,9, la force d’une connexion donnée entre une paire de neurones est tributaire de trois facteurs : le nombre de synapses fonctionnelles (N), le postsynaptique réaction à la publication d’une seule Vésicule synaptique (taille quantique ; Q) et la probabilité de la libération des neurotransmetteurs (P,r). Multiplicité de synaptique est équivalente à N. Le développement de la multiplicité synaptique ou l’élagage des synapses multiplicatifs est en plastique tout au long de l’élaboration et la maladie différents États3,4,6,10. Pour cette raison, caractérisant la multiplicité synaptique a des implications importantes pour la compréhension de l’efficacité de la transmission synaptique dans la santé et la maladie. Techniques, telles que la microscopie électronique peuvent d’identifier des preuves de structure synaptique multiplicité en détectant des contacts synaptiques multiples provenant de l’axone même sur le même neurone postsynaptique11,12, 13,14. Cependant, ces multisynapses structurellement identifiés peuvent être fonctionnellement silencieux15,16. Examen fonctionnel précis de N exige techniquement difficile des approches électrophysiologiques, tels que les enregistrements de cellules entières paires qui peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs sites de rejet fonctionnelle et minimal approches de stimulation qui visent à recruter un seul axone putatif.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique en adoptant une méthode développée initialement par Hsia et al.,2. Cette technique consiste à mesurer la spontanée PSC (SLES SSP) et MPSC à l’aide d’électrophysiologie de cellules entières patch clamp, qui nous permet d’estimer le degré de multiplicité synaptique parmi toutes les entrées d’un neurone donné.  Tel que définie précédemment, synaptique multiplicité reflète le nombre de synapses entre un neurone donné en pré- et post-synaptiques. Si plusieurs synapses sont recrutés en même temps par un potentiel d’action, il y aura une forte probabilité de sommation temporelle des différents SSP (i.e. quantique), générant une plus grande amplitude CFP.  Dans les enregistrements de la mPSC (dans quels potentiels d’action sont bloqués par TTX), il est peu probable de sommation temporelle des individuels MPSC (non-synchrone). À l’aide de ce raisonnement, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude sPSC (avec libération de potentiel d’action-dépendante) à l’amplitude de la mPSC.

Pour déterminer l’existence d’une multiplicité, les auteurs décrivent quatre expériences et leurs analyses utilisant glutamatergique EPSCs comme exemple. Cependant, la même approche peut être utilisée pour le jeûne transmission GABAergique/glycinergic (CISP). Une brève justification de chaque expérience est décrite ci-dessous. Tout d’abord, comme expliqué ci-dessus, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude de sEPSCs à mEPSCs. Il existe deux conditions pour cette approche ; 1) présynaptiques axones doivent avoir un nombre suffisant de potentiels d’action pendant l’enregistrement, et 2) Pr doit être grande pour que plusieurs synapses libération neurotransmetteur à l’arrivée d’un potentiel d’action. Afin de répondre à ces exigences, sEPSCs sont pour la première fois en bas Ca2 + artificiel liquide céphalo-rachidien (aCSF) et ensuite enregistrées en présence d’une faible concentration de l’antagoniste des canaux K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) pour augmenter l’action potentiel de tir et Pr. Puis, potentiel d’action tir est bloquée par la TTX et Pr diminué par un voltage-dépendants Ca2 + bloqueur des canaux Cd2 +. L’amplitude de sEPSCs (avec 4AP) est comparée à celle de Cpsem (avec 4AP, TTX et Cd2 +). Dans la seconde expérience, Ca2 + est remplacé par équimolaire Sr2 + dans le FSCA pour désynchroniser la libération des vésicules. Comme Ca2 + est nécessaire pour la version synchrone de vésicules, remplacement avec Sr2 + devrait éliminer le sEPSCs de grande amplitude qui témoignent de la multiplicité. En troisième lieu, mécaniquement, c’est la multiplicité peut résulter de multiples contacts synaptiques au même neurone postsynaptique ou libération multivésiculaires (c’est-à-dire plusieurs vésicules libérés au sein d’un même contact synaptique)17,18. Pour différencier les deux types de la multiplicité, la troisième expérience utilise une faible affinité, rapide dissociation antagoniste compétitif des récepteurs AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , afin de déterminer si grand sEPSC sont le résultat de la sommation temporelle des synapses indépendants ou libération multivésiculaires agissant sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Si les événements de grande amplitude résultent de la dissémination multivésiculaires, γ-DGG sera moins efficace pour inhiber les plus sEPSCs par rapport aux plus petits, tandis que le grand sEPSCs qui découlent de la sommation temporelle de plusieurs contacts synaptiques seront affectés de la même manière par Γ-DGG. Dans la quatrième expérience, une méthode plus physiologique est utilisée pour renforcer le potentiel d’action tir, à savoir afférente stimulation synaptique. Rafales de l’activité synaptique peuvent transitoirement augmentation/faciliter la probabilité de mise à feu et de la libération de potentiel d’action spontanée des afférences stimulées. Par conséquent, cette approche permet de multiplicité de manifester d’une manière plus physiologique.

Le protocole suivant décrit la méthode pour mener ces expériences en tissu hypothalamique de souris. Plus précisément, corticotropin libérant l’hormone (CRH) des neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) sont utilisés. Nous décrivons les procédures pour la conduite d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp et expliquer les expériences spécifiques pour tester la multiplicité synaptique.

Protocol

Toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Western Ontario selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines (PUA #2014-031). 1. les solutions Solution de tranchage Référer au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage. Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois. Pour 1 x tranc…

Representative Results

Le protocole ci-dessus décrit une méthode permettant d’utiliser électrophysiologie de germes entiers patch clamp pour examiner le degré de multiplicité synaptique, à l’aide de neurones hypothalamiques souris à titre d’exemple. Cette technique de préparation de tranche devrait produire des cellules viables en bonne santé qui n’ont pas une membrane gonflée ou noyau (Figure 1). Chaque étape du protocole est important pour la santé du tissu et la qualité …

Discussion

Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accep…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.S. a reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario. W.I. a reçu une nouvelle bourse de chercheur de recherche en santé mentale du Canada. Ce travail est soutenu par les subventions de fonctionnement à Florian de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada (06106-2015 RGPIN) et l’Institut canadien de recherche en santé (PJT 148707).

Materials

1 ml syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 uM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Play Video

Cite This Article
Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

View Video