Summary

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Published: April 23, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Beurteilung der funktionalen synaptischen Mannigfaltigkeit mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten.

Abstract

In das zentrale Nervensystem bilden ein paar Neuronen oft mehrere synaptischen Kontakte und/oder funktionalen Neurotransmitter Freisetzungsstandorten (synaptische Multiplizität). Synaptische Vielheit ist aus Kunststoff und Änderungen während der Entwicklung und in verschiedenen physiologischen Bedingungen, wird ein wichtiger Faktor für die Effizienz der synaptischen Übertragung. Hier erläutern wir Experimente für die Schätzung des Grades der Vielzahl von Synapsen auf einen bestimmten postsynaptischen Neuron mit ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten zu beenden. Insbesondere ist Voltage-Clamp-Aufnahme verwendet, um die Differenz zwischen der Amplitude des spontanen exzitatorischen postsynaptischen Ströme (sEPSCs) und Miniatur exzitatorischen postsynaptischen Ströme (mEPSCs) zu vergleichen. Die Theorie hinter dieser Methode ist, dass afferenten Inputs, die Vielfalt zu zeigen große, Aktionspotential-abhängigen sEPSCs durch die synchrone Version angezeigt werden, die bei jedem synaptischen Kontakt auftritt. Im Gegensatz dazu wird Aktionspotential-unabhängige Version (das asynchrone) kleiner Amplitude mEPSCs generieren. Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Experimenten und Analysen, die Existenz der synaptischen Vielheit zu charakterisieren und beschreibt die Anforderungen und Grenzen der Technik. Diese Technik kann angewendet werden, wie verschiedene Verhaltensstörungen, pharmakologische oder ökologischen Eingriffe in Vivo betreffen die Organisation der synaptischen Kontakte in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Introduction

Synaptische Übertragung ist ein grundlegender Mechanismus für die Kommunikation zwischen den Neuronen, und daher Gehirnfunktion. Synaptische Übertragung ist auch labil und kann seine Wirksamkeit eine aktivitätsabhängige ebenso wie in Reaktion auf modulierende Signale1ändern. So wurde das synaptischen Funktion untersuchen ein Schlüsselfokus der neurowissenschaftlichen Forschung. Ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie ist eine vielseitige Technik, die uns zu verstehen, durch Erarbeitung experimenteller Designs und Datenanalysen, detaillierte biophysikalische und molekulare Mechanismen der synaptischen Übertragung ermöglicht. Ein häufig verwendeter Ansatz vielleicht aufgrund der Einfachheit der Technik und Konzept, ist die Messung der Miniatur exzitatorischen/inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mE / IPSCs) unter Spannung Klemme Konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. einzelne mPSCs repräsentieren den Fluss von Ionen durch Ionotropic postsynaptischen Rezeptoren (z. B. AMPA und GABA-A -Rezeptoren) in Reaktion auf die Bindung von ihren jeweiligen Neurotransmitter aus den präsynaptischen Terminal 7 freigegeben . Da die Aufnahme im Beisein der Voltage-gated Na+ -Kanal-Blocker Tetrodotoxin (TTX) vorliegt, das Release ist Aktionspotential-unabhängig und beinhaltet normalerweise eine einzelne synaptische Vesikel, die Neurotransmitter enthält. Ausgehend von dieser Annahme, ist die durchschnittliche Amplitude der mPSCs allgemein als grobe Schätzung für die Quanten Größe verwendet, die steht für die Anzahl und die Funktionalität der postsynaptischen Rezeptoren gegen eine single-Auskopplung-Website. Auf der anderen Seite gilt als die Frequenz des mPSCs, eine Kombination aus der Gesamtzahl der Synapsen auf der postsynaptischen Zelle und Eintrittswahrscheinlichkeit durchschnittliche Freigabe beenden zu vertreten. Diese Parameter messen jedoch nicht eine weitere Variable Multiplicativity von Synapsen und synaptische Vielfalt – das ist wichtig für die Effizienz der synaptischen Übertragung.

Basierend auf der Quanten Theorie der synaptischen Übertragung7,8,9, die Stärke einer gegebenen Verbindung zwischen zwei Neuronen ist abhängig von drei Faktoren: die Anzahl der funktionellen Synapsen (N), die postsynaptischen Reaktion auf die Veröffentlichung einer einzigen synaptischen Vesikel (Quanten Größe; Q) und die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung von Neurotransmittern (P-R). Synaptische Multiplizität ist äquivalent zu N. Die Entwicklung der synaptischen Vielheit oder das Beschneiden der multiplikativen Synapsen ist Kunststoff während der Entwicklung und in anderen Krankheit Staaten3,4,6,10. Aus diesem Grund hat Charakterisierung synaptischen Vielzahl wichtige Implikationen für die Effizienz der synaptischen Übertragung in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Techniken, wie z. B. Elektronenmikroskopie können strukturelle Beweise der synaptischen Multiplizität identifizieren, indem er erkennt mehrere synaptischen Kontakte mit Ursprung aus dem gleichen Axon auf der gleichen postsynaptischen Neuron-11,12, 13,14. Diese strukturell identifizierten Multisynapses kann jedoch funktional Stille15,16. Genaue funktionelle Untersuchung des N erfordert technisch anspruchsvolle elektrophysiologische Ansätze wie gekoppelten ganz-Zell-Aufnahmen, die erkennen, ob eine bestimmte Verbindung mehrerer Standorte der funktionalen Release hat und minimale Stimulation-Ansätze, die darauf abzielen, ein einziges vermeintliche Axon zu rekrutieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Schätzung der synaptischen Vielfalt durch die Annahme einer Methode, die ursprünglich von Hsia Et al.2entwickelt. Diese Technik beinhaltet die Messung der spontanen PSCs (sPSCs) und mPSCs mit ganze Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, was uns erlaubt, die Schätzung des synaptischen Vielfalt über alle Eingaben für ein bestimmtes Neuron.  Da zuvor definierten, synaptische Mannigfaltigkeit die Anzahl der Synapsen zwischen eines bestimmten Prä- und postsynaptischen Neurons widerspiegelt. Wenn mehrere Synapsen synchron durch ein Aktionspotential rekrutiert werden, werden mit hoher Wahrscheinlichkeit zeitliche Summierung der einzelnen (d.h. Quanten) EAP, erzeugen eine größere Amplitude PSC.  MPSC Aufnahmen (in denen Aktionspotentiale durch TTX blockiert sind), die Wahrscheinlichkeit der zeitliche Summierung der einzelnen (nicht-synchrone) mPSCs ist gering. Mit dieser Begründung, werden synaptische Multiplizität abgeschätzt durch den Vergleich der sPSC Amplitude (mit Aktionspotential-abhängige Version) auf die mPSC Amplitude.

Um die Existenz der Multiplizität untersuchen beschreiben wir vier Experimente und ihre Analysen mit glutamatergen EPSCs als Beispiel. Jedoch kann der gleiche Ansatz verwendet werden, für die schnelle Übertragung der GABAergen/glycinergen (IPSCs). Eine kurze Begründung für jedes Experiment wird nachfolgend beschrieben. Zunächst, wie oben erläutert, synaptische Multiplizität abgeschätzt werden durch den Vergleich der Amplitude der sEPSCs zu mEPSCs. Es gibt zwei Anforderungen für diesen Ansatz; (1) präsynaptischen Axone müssen eine ausreichende Anzahl von Aktionspotentialen Feuer, während der Aufnahme, und (2) PR muss hoch sein, so dass mehrere Synapsen Neurotransmitter bei der Ankunft ein Aktionspotenzial freigeben. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, sEPSCs sind zuerst aufgenommen in niedrigen Ca2 + künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS), und dann in der Gegenwart eine niedrige Konzentration von K+ -Kanal-Antagonisten, 4-Aminopyridine (4-AP) Aktion erhöhen möglichen Zündung und PR. Dann feuern Aktionspotential TTX und Pr sank um ein Voltage-gated Ca2 + -Kanal-Blocker Cd2 +wehrt. Die Amplitude der sEPSCs (mit 4AP) ist im Vergleich zu der mEPSC (mit 4AP, TTX und Cd2 +). Im zweiten Experiment ist Ca2 + äquimolaren Sr2 + in der ACFS, Vesikel Release Synchronisierung abgelöst. Als Ca2 + für die synchrone Version von Vesikeln erforderlich ist, sollte Ersatz mit Sr2 + großer Amplitude sEPSCs beseitigen, die Vielheit bezeichnend sind. Drittens, mechanistisch, Multiplizität kann ergeben sich aus entweder mehrere synaptischen Kontakte gleichen postsynaptischen Neuron oder multivesicular Version (d. h. mehrere Bläschen innerhalb einer einzigen synaptischen Kontakt freigegeben)17,18. Um zwischen den beiden Arten der Vielheit zu unterscheiden, verwendet das dritte Experiment eine geringe Affinität, schnelle trennendem kompetitiver Antagonist des AMPA-Rezeptoren, γ-D-Glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , um festzustellen, ob groß sEPSC sind das Ergebnis der zeitliche Summation der unabhängigen Synapsen oder multivesicular Version, die auf einer überlappenden Bevölkerung der postsynaptischen Rezeptoren. Im Falle großer Amplitude Veranstaltungen von multivesicular Release werden γ-DGG weniger effektiv bei der Hemmung größer im Vergleich zu kleineren sEPSCs während der großen sEPSCs, die durch die zeitliche Summierung von mehreren synaptischen Kontakte entstehen in ähnlicher Weise betroffen sind Γ-DGG. Im vierten Versuch ist eine physiologische Methode zum Aktionspotential brennen, nämlich afferenten synaptic Stimulation zu erhöhen. Platzt der synaptischen Aktivität können vorübergehend erhöhen/die spontane Aktionspotential abfeuern und Freigabe Wahrscheinlichkeit angeregten Afferenzen erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht daher Multiplizität in physiologischer Weise manifestieren.

Das folgende Protokoll beschreibt die Methode für die Durchführung dieser Experimente im Hypothalamus Gewebe Maus. Insbesondere werden Corticotropin releasing Hormon (CRH) Neuronen des Nucleus paraventrikulären des Hypothalamus (PVN) verwendet. Wir beschreiben die Verfahren für die Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie und erläutern die spezifischen Experimente für synaptische Vielheit zu testen.

Protocol

Alle Tierversuche werden von Animal Care Committee der University of Western Ontario im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien (AUP #2014-031) genehmigt. (1) Lösungen Slicing Lösung Die Zusammensetzung der Slice-Lösung finden Sie unter Tabelle 1 . Bereiten Sie im Voraus eine 20-fach-Stammlösung und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Lösen Sie für 1 X Schneid-Lösung Nahco3<su…

Representative Results

Das obige Protokoll beschreibt eine Methode für die Verwendung von ganzen Zelle Patch Clamp Elektrophysiologie, um den Grad der synaptischen Vielfältigkeit, mit der Maus Hypothalamus Neuronen als Beispiel zu untersuchen. Diese Scheibe Präparationstechnik sollte gesunde vitaler Zellen ergeben, die nicht über eine geschwollene Membran oder Kern (Abbildung 1). Jeder Schritt im Protokoll ist wichtig für die Gesundheit des Gewebes und der Qualität der Aufnahmen. <p c…

Discussion

Eine wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Patch Clamp Elektrophysiologie Experiment ist gesunde Scheiben/Zellen erhalten. Unsere beschriebenen Protokoll ist optimiert für Hypothalamus Scheiben, die PVN Neuronen enthalten. Anderen Gehirn benötigten Bereichen modifizierte Lösungen und slicing Methoden21,22,23,24. Für die Aufnahme ist es wichtig, stabile Aufnahmen akzeptieren nur durc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.s. erhielt Ontario Graduate Stipendium. W.I Stipendium ein neue Ermittler aus Mental Health Research Kanada. Diese Arbeit wird unterstützt durch Betriebskostenzuschüsse, Wi aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) und des Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Materials

1 ml syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 uM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

References

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Cite This Article
Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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