Summary

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

Abstract

במערכת העצבים המרכזית, זוג של הנוירונים יוצרים לעתים קרובות מספר קשרים סינפטיים ו/או אתרים שחרור נוירוטרנסמיטר פונקציונלי (ריבוי סינפטית). ריבוי סינפטית היא פלסטיק ושינויים במהלך הפיתוח, בתנאים פיזיולוגיים שונים, להיות דטרמיננטה חשוב עבור היעילות של ההעברה הסינאפסית. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ניסויים עבור הערכת מידת הריבוי של הסינפסות הפסקת אל נוירון postsynaptic נתון באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה. באופן ספציפי, מתח-קלאמפ הקלטה משמש כדי להשוות את ההבדל בין את משרעת של זרמי postsynaptic סינאפסות ספונטנית (sEPSCs) וזרמים מיניאטורי סינאפסות postsynaptic (mEPSCs). התיאוריה מאחורי שיטה זו הוא כי תשומות מביא כי התערוכה ריבוי יראה sEPSCs גדול, תלויי-פוטנציאל הפעולה בעקבות יציאתו סינכרונית המתרחשת על כל איש קשר סינפטית. לעומת זאת, שחרור ללא תלות פוטנציאל הפעולה (וזה אסינכרוני) יפיק mEPSCs משרעת קטנים יותר. מאמר זה מתאר קבוצה של ניסויים וניתוחים לאפיין את קיומו של ריבוי סינפטית ודן את הדרישות ואת המגבלות של הטכניקה. טכניקה זו ניתן להחיל לחקור כמה שונה התערבויות התנהגותיות, תרופתי או סביבתיים בתחום vivo משפיעים על הארגון של קשרים סינפטיים באזורי מוח שונים.

Introduction

הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory1. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs בודדים לייצג את הזרימה של יונים דרך רצפטורים postsynaptic ionotropic (למשל קולטנים אמפא ו- GABAA ) בתגובה הכריכה של נוירוטרנסמיטורים בהתאמה שלהם שוחרר ממסוף presynaptic 7 . כי ההקלטה מתקבל בנוכחות ממותגת מתח Na+ ערוץ חוסם טטרודוטוקסין (TTX), שחרורו אינו תלוי-פוטנציאל הפעולה, בדרך כלל כרוך שלפוחית סינפטית יחיד המכיל עצבי. בהתבסס על הנחה זו, משרעת הממוצע של mPSCs הוא בשימוש נרחב הערכה גסה עבור גודל quantal, המייצגת את המספר ואת הפונקציונליות של קולטנים postsynaptic מנוגדות אתר שחרור יחיד. מצד שני, התדירות של mPSCs נחשבת מייצגים שילוב של המספר הכולל של הסינפסות הפסקת אל התא postsynaptic והסתברות שחרור הממוצע שלהם. עם זאת, פרמטרים אלה לא מאפשרות למדוד משתנה נוסף-multiplicativity של הסינפסות, או ריבוי סינפטית – דבר חשוב היעילות של ההעברה הסינאפסית.

בהתבסס על תורת הסינאפסית7,8,9quantal, הכוח של חיבור נתון בין זוג נוירונים הוא תלוי בשלושה גורמים: המספר של הסינפסות פונקציונלי (N), postsynaptic בתגובה שחרורו של שלפוחית סינפטית יחיד (גודל quantal; Q), ההסתברות של שחרור נוירוטרנסמיטר (Pr). ריבוי סינפטית שווה ל N. הפיתוח של ריבוי סינפטית או על גיזום של הסינפסות אוילר הוא פלסטיק במהלך הפיתוח, מחלות שונות הברית3,4,6,10. מסיבה זו, אפיון ריבוי סינפטית יש השלכות חשובות להבנת את היעילות של ההעברה הסינאפסית על בריאות ומחלה. טכניקות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לזהות ראיות מבניות של ריבוי סינפטית על ידי גילוי מספר מגעים סינפטית שמקורם הדנדריטי לאקסון אותו על גבי אותו נוירון postsynaptic11,12, 13,14. עם זאת, multisynapses מזוהה מבחינה מבנית האלו ניתן באופן פונקציונלי שקט15,16. ירידה תפקודית מדוקדקת של N דורש טכנית מאתגר גישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות שלם-תא לזווג אשר יכול לזהות אם חיבור נתון יש מספר אתרי פרסום פונקציונלי מינימלית גישות גירוי שואפים לגייס של האקסון בשם יחיד.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור הערכת ריבוי סינפטית על ידי אימוץ שיטה שפותחה במקור מאת Hsia ואח ‘2. טכניקה זו כרוכה המדידה של ספונטנית מגירסה (sPSCs), mPSCs באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, אשר מאפשר לנו לאמוד את מידת הריבוי סינפטית על-פני כל כניסות ליציאה נוירון מסוים.  כפי שהוגדרו בעבר, סינפטית ריבוי משקף את המספר של הסינפסות בין נוירון קדם ו postsynaptic נתון. אם הסינפסות מרובים גייסו בסנכרון ידי פוטנציאל הפעולה, תהיה הסתברות גבוהה של סיכום זמני של הפרט מגירסה (קרי quantal), יצירת של משרעת גדולה PSC.  בהקלטות mPSC (איזה פוטנציאל פעולה הנחסמים על-ידי TTX), ההסתברות של סיכום זמני של הפרט mPSCs (שאינם סינכרוני) הוא נמוך. באמצעות רציונל זה, ריבוי סינפטית יכול להיות מוערך על-ידי השוואת את משרעת sPSC (עם פוטנציאל הפעולה תלוית שחרור) משרעת mPSC.

כדי לבחון את קיומו של ריבוי אנו מתארים ארבעה ניסויים וניתוחים שלהם glutamatergic EPSCs כדוגמא. לעומת זאת, אותה גישה יכול לשמש עבור הצום שידור GABAergic/glycinergic (IPSCs). תירוץ קצר עבור כל הניסוי המתואר להלן. ראשית, כפי שהוסבר לעיל, יכול להיות מוערך ריבוי סינפטית על-ידי השוואת את משרעת של sEPSCs כדי mEPSCs. ישנם שתי דרישות גישה זו; אקסונים presynaptic 1) חייב לירות מספר מספיק של פוטנציאל פעולה במהלך ההקלטה, ועל 2) Pr להיות גבוהה כך הסינפסות מרובים שחרור נוירוטרנסמיטר בעת ההגעה של פוטנציאל הפעולה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, sEPSCs הן שהוקלט לראשונה ב נמוך Ca2 + מלאכותי השדרתי (כלנית חדד), לאחר מכן הקליט בנוכחות ריכוז נמוך של אנטגוניסט ערוץ K+ , פמפרידין (4-AP) כדי להגדיל את הפעולה ירי פוטנציאל ו- Pr. ואז פוטנציאל הפעולה ירי חסומה על-ידי TTX ו- Pr הופחתו ממותגת מתח Ca2 + ערוץ חוסם Cd2 +. משרעת של sEPSCs (עם 4AP) בהשוואה לזה של mEPSC (עם 4AP, TTX ו Cd2 +). הניסוי השני, Ca2 + מוחלף על-ידי equimolar Sr2 + ב חנה המבר כדי בטל סינכרון שלפוחית שחרור. כפי Ca2 + נדרש לשחרור סינכרונית של שלפוחית, החלפת עם Sr2 + אמור לחסל את sEPSCs משרעת גדולה זה מרמז על ריבוי. שלישית, mechanistically, ריבוי יכול לנבוע גם קשרים סינפטיים מרובים באותו נוירון postsynaptic או שחרור multivesicular (קרי מספר שלפוחית שוחרר איש קשר סינפטית יחיד)17,18. כדי להבדיל בין שני סוגים של ריבוי, הניסוי השלישי משתמש עם זיקה נמוכה, מהיר בריא תחרותי אנטגוניסט של אמפא רצפטורים, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 כדי לקבוע אם גדול sEPSC הם התוצאה של סיכום טמפורלית הסינפסות עצמאית או שחרור multivesicular פועל על אוכלוסיה חופפים של קולטני postsynaptic. אם האירועים משרעת גדולה נובעים שחרור multivesicular, וγ-DGG יהיה פחות יעיל עיכוב sEPSCs בהשוואה קטן יותר גדול יותר, ואילו sEPSCs גדולים הנובעים מן הסיכום הטמפורלי של אנשי קשר מרובים סינפטית יושפעו באופן דומה על-ידי Γ-DGG. במהלך הניסוי הרביעי, שיטה יותר פיזיולוגית משמש כדי לשפר את פוטנציאל הפעולה בירי, כלומר מביא לגירוי סינפטית. התפרצויות של פעילות סינפטית יכול transiently עלייה/להקל על פוטנציאל הפעולה הספונטנית ירי ושחרור ההסתברות afferents מגורה. לכן, גישה זו מאפשרת ריבוי להפגין בצורה יותר פיזיולוגית.

הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת עבור ניסויים אלה ברקמת היפותלמי העכבר. באופן ספציפי, משמשים corticotropin נוירונים הורמון (CRH) שיחרור של גרעין paraventricular ההיפותלמוס (PVN). אנו מתארים את נהלי ביצוע תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, להסביר את הניסויים ספציפיים כדי לבדוק את הריבוי סינפטית.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי ועדת אכפת של מאוניברסיטת מערב אונטריו לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים (AUP #2014-031) של בעלי חיים. 1. פתרונות פתרון עם פרוסות עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון עם פרוסות. להכין פתרון מניות 20 x מראש …

Representative Results

הפרוטוקול הנ ל מתאר שיטה באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה לבחון את מידת הריבוי סינפטית, נוירונים היפותלמי העכבר כדוגמא. טכניקה זו הכנה פרוסה אמור להניב התאים קיימא בריא זה לא יש ממברנה נפוחות או גרעין (איור 1). כל שלב בפרוטוקול זה חשוב לבריאות של רקמות,…

Discussion

דרישה חשובה אחת עבור ניסוי אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון מוצלח הוא קבלת פרוסות/תאים בריאים. הפרוטוקול המתואר שלנו ממוטב היפותלמי פרוסות המכילות PVN נוירונים. אחרים במוח אזורים עשויים לדרוש ששינה פתרונות, עם פרוסות שיטות21,22,23,<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

י. ס קיבל מלגה לתואר שני אונטריו. W.I. קיבל מלגת חוקר חדש למחקר בריאות הנפש קנדה. עבודה זו נתמכת על ידי ההפעלה מענקים כדי W.I של מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (06106-2015 RGPIN) ומכון קנדי למחקר בריאות (PJT 148707).

Materials

1 ml syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 uM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).

Play Video

Cite This Article
Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

View Video