पूरे सेल पैच का उपयोग कर Synaptic बहुलता का मूल्यांकन-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
Summary
यहाँ, हम तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कार्यात्मक synaptic बहुलता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, न्यूरॉन्स की एक जोड़ी अक्सर एकाधिक synaptic संपर्कों और/या कार्यात्मक न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज साइटों (synaptic बहुलता) के रूप में । Synaptic बहुलता प्लास्टिक और विकास के दौरान परिवर्तन और विभिंन शारीरिक स्थितियों में, Synaptic संचरण की प्रभावकारिता के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक होने के नाते है । यहाँ, हम एक दिए गए postsynaptic न्यूरॉन पर समाप्त synapses की बहुलता की विविधता की डिग्री का आकलन करने के लिए प्रयोगों की रूपरेखा तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग. विशेष रूप से, वोल्टेज-दबाना रिकॉर्डिंग स्वत स्फूर्त postsynaptic धाराओं (sEPSCs) और लघु उत्तेजना postsynaptic धाराओं (mEPSCs) के आयाम के बीच अंतर की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस पद्धति के पीछे सिद्धांत यह है कि अभिवाही आदानों कि बहुलता प्रदर्शन बड़ी, कार्रवाई क्षमता पर निर्भर sepscs तुल्यकालिक रिहाई है कि प्रत्येक synaptic संपर्क में होता है के कारण दिखाई देगा । इसके विपरीत, कार्रवाई क्षमता स्वतंत्र रिहाई (जो एसिंक्रोनस है) छोटे आयाम mEPSCs उत्पन्न होगा. इस आलेख में synaptic बहुलता के अस्तित्व की विशेषता और तकनीक की आवश्यकताओं और सीमाओं पर चर्चा करने के लिए प्रयोगों और विश्लेषणों का एक सेट रेखांकित किया गया है । इस तकनीक की जांच कैसे अलग व्यवहार, औषधीय या vivo में पर्यावरण हस्तक्षेप विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic संपर्कों के संगठन को प्रभावित करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Synaptic संचरण ंयूरॉंस के बीच संचार के लिए एक बुनियादी तंत्र है, और इसलिए, मस्तिष्क समारोह । Synaptic संचरण भी अस्थिर है और एक गतिविधि पर निर्भर तरीके से अपनी प्रभावकारिता बदल सकते है और साथ ही modulatory संकेतों1के जवाब में । इस प्रकार, synaptic समारोह की जांच तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के एक मुख्य ध्यान केंद्रित किया गया है । संपूर्ण-कोशिका पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एक बहुमुखी तकनीक है जो हमें प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण तैयार करके, synaptic संचरण के गहन जैव भौतिक और आणविक तंत्र को समझने में सक्षम बनाती है । एक आम तौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण, शायद तकनीक और अवधारणा की सादगी के कारण, लघु उत्तेजना की माप है/संदरोधात्मक postsynaptic धाराओं (mE/ 4 । , 5 । , 6. व्यक्तिगत एमपीएससी पोस्टसिनप्टिक ionotropic रिसेप्टर्स (उदा. AMPA और गाबाएक रिसेप्टर्स) के माध्यम से आयनों के प्रवाह का प्रतिनिधित्व अपने संबंधित न्यूरोट्रांसमीटर के बंधन के जवाब में presynaptic टर्मिनल से जारी 7 . क्योंकि रिकॉर्डिंग वोल्टेज-gated एनए+ चैनल अवरोधक tetrodotoxin (ttx) की उपस्थिति में प्राप्त की है, रिहाई कार्रवाई की क्षमता स्वतंत्र है और सामान्य रूप से न्यूरोट्रांसमीटर शामिल है कि एक एकल synaptic पुटिका शामिल है. इस धारणा के आधार पर, mPSCs के औसत आयाम व्यापक रूप से क्वांटल आकार है, जो एक ही रिलीज साइट का विरोध postsynaptic रिसेप्टर्स की संख्या और कार्यक्षमता का प्रतिनिधित्व करता है के लिए एक कच्चे तेल के अनुमान के रूप में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, mPSCs की आवृत्ति postsynaptic सेल और उनके औसत रिलीज संभावना पर समाप्त synapses की कुल संख्या का एक संयोजन का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है । तथापि, इन मापदंडों synapses, या synapses बहुलता की एक और चर-गुणनात्मकता उपाय नहीं है-जो synapses संचरण की प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है ।
Synaptic संचरण के क्वांटल सिद्धांत के आधार पर7,8,9, न्यूरॉन्स की एक जोड़ी के बीच एक दिए गए कनेक्शन की शक्ति तीन कारकों पर निर्भर है: कार्यात्मक synaptic की संख्या (एन), एक एकल synaptic पुटिका के रिलीज के लिए postsynaptic प्रतिक्रिया (क्वांटल आकार; क्यू) और न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की संभावना (पीआर). Synaptic बहुकता Nके बराबर है । Synaptic बहुलता या गुणात्मक synaptic की pruning के विकास के विकास में प्लास्टिक और विभिंन रोगों राज्यों में3,4,6,10है । इस कारण से, अभिलक्षणन synaptic बहुकता स्वास्थ्य और रोग में synaptic संचरण की प्रभावकारिता को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । ऐसी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में तकनीक, एक ही postsynaptic न्यूरॉन11,12पर एक ही अक्षतंतु से उद्भव एकाधिक synaptic संपर्कों का पता लगाने के द्वारा synaptic बहुलता के संरचनात्मक सबूत की पहचान कर सकते हैं, 13,14. हालांकि, इन संरचनात्मक रूप से चिह्नित multisynapses कार्यात्मक रूप से चुप15,16हो सकता है । N की सटीक कार्यात्मक परीक्षा के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है, जैसे युग्मित पूर्ण-सेल रिकॉर्डिंग जो यह पहचान सकते हैं कि क्या दिए गए कनेक्शन में एकाधिक कार्यात्मक रिलीज़ साइटें और न्यूनतम उत्तेजना दृष्टिकोण है कि उद्देश्य एक ख्यात अक्षतंतु की भर्ती के लिए ।
इस प्रोटोकॉल में, हम मूल रूप से Hsia एट अल2द्वारा विकसित एक विधि को अपनाकर synaptic बहुलता का आकलन करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं । इस तकनीक में सहज पीएससी (sPSCs) और mPSCs का मापन संपूर्ण-कोशिका पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करना शामिल है, जो हमें एक दिया न्यूरॉन के लिए सभी आदानों में synaptic बहुलता की डिग्री का अनुमान लगाने की अनुमति देता है । के रूप में पहले से परिभाषित, synaptic बहुकता एक दिया पूर्व और postsynaptic ंयूरॉन के बीच synaptic की संख्या को दर्शाता है । यदि एकाधिक synapses एक कार्रवाई की क्षमता से synapses में भर्ती कर रहे हैं, वहां एक व्यक्ति (यानी क्वांटल) PSCs के लौकिक योग की एक उच्च संभावना होगी, एक बड़ा आयाम पीएससी पैदा । एमपीपीएससी रिकॉर्डिंग्स (जिसमें कार्य क्षमता TTX द्वारा अवरोधित की गई हैं) में, वैयक्तिक (गैर-तुल्यकालिक) mPSCs के कालिक संकलन की संभावना कम है । इस तर्क का उपयोग करते हुए, synaptic बहुकता sPSC आयाम (के साथ कार्रवाई क्षमता निर्भर रिहाई) mPSC आयाम करने के लिए तुलना करके अनुमान लगाया जा सकता है ।
बहुलता के अस्तित्व की जांच करने के लिए हम ग्लूटामैटेजिक ईपीएससी का प्रयोग करते हुए एक उदाहरण के रूप में चार प्रयोगों और उनके विश्लेषणों का वर्णन करते हैं । हालांकि इसी अप्रोच का इस्तेमाल तेज गैबएरोजिक/ग्लाइसिनर्जिक ट्रांसमिशन (आईपीएससी) के लिए किया जा सकता है । प्रत्येक प्रयोग के लिए एक संक्षिप्त तर्क नीचे वर्णित है । पहला, जैसा कि ऊपर बताया गया है, मेपीएससी में सेप्पीएससी के आयाम की तुलना करके synaptic बहुलता का अनुमान लगाया जा सकता है । इस प्रकिया के लिए दो आवश्यकताएं हैं; 1) presynaptic axons रिकॉर्डिंग के दौरान कार्रवाई की क्षमता के एक पर्याप्त संख्या में आग चाहिए, और 2) Pr उच्च होना चाहिए ताकि एकाधिक synapses एक कार्रवाई की क्षमता के आगमन पर न्यूरोट्रांसमीटर जारी । आदेश में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, sEPSCs पहले कम Ca2 + कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (acsf) में दर्ज कर रहे हैं, और फिर कश्मीर के एक कम एकाग्रता की उपस्थिति में दर्ज की गई+ चैनल विरोधी, 4-Aminopyridine (4-एपी) कार्रवाई बढ़ाने के लिए संभावित फायरिंग और पीआर। फिर कार्रवाई संभावित फायरिंग TTX द्वारा अवरुद्ध है और पीआर एक वोल्टेज-gated Ca2 + चैनल ब्लॉकर सीडी2 +द्वारा कमी आई है । (4AP) के साथ sEPSCs के आयाम mEPSC की तुलना में है (4AP, TTX, और सीडी2 +) के साथ । दूसरे प्रयोग में, Ca2 + equimolar Sr द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है2 + acsf में आशय रिहाई desynchronize करने के लिए. के रूप में Ca2 + vesicles के तुल्यकालिक रिहाई के लिए आवश्यक है, Sr के साथ प्रतिस्थापन2 + बड़े आयाम sepscs कि बहुलता का संकेत कर रहे हैं को समाप्त करना चाहिए । तीसरा, यंत्रवत्, बहुलता या तो एकाधिक synaptic संपर्कों से एक ही postsynaptic ंयूरॉन या multivesicular रिहाई के लिए परिणाम कर सकते है (यानी एकाधिक पुटिकाओं एक एकल synaptic संपर्क के भीतर जारी)17,18। बहुलता के दो प्रकारों के बीच अंतर करने के लिए, तीसरा प्रयोग एक कम आत्मीयता का उपयोग करता है, तेजी से, AMPA रिसेप्टर्स के प्रतिस्पर्धी प्रतिपक्षी वियोजी, γ-डी-ग्लूटामिलेग्लाइसिन (γ-dgg)17,18 निर्धारित करने के लिए कि क्या बड़े सेप्टीएससी, पोस्टसिंथेटिक रिसेप्टर्स की एक अतिव्यापी जनसंख्या पर अभिनय स्वतंत्र synapses या multivesicular रिहाई के लौकिक संकलन का परिणाम हैं. यदि बड़े आयाम की घटनाओं से उत्पन्न होने वाली बहुतलीय रिहाई, γ-DGG छोटे sEPSCs की तुलना में बड़ा बाधा पर कम प्रभावी होगा, जबकि कई synaptic संपर्कों के अस्थायी योग से उत्पन्न होने वाले बड़े sEPSCs इसी तरह से प्रभावित हो जाएगा γ-डीजीजी । चौथे प्रयोग में, एक अधिक शारीरिक विधि के लिए कार्रवाई की क्षमता फायरिंग, अर्थात् अभिवाही synaptic उत्तेजना को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है । Synaptic गतिविधि के फटने transiently वृद्धि/सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग और उत्तेजित afferents की रिहाई की संभावना की सुविधा कर सकते हैं । इसलिए, यह दृष्टिकोण बहुलता को अधिक शरीरक्रियात्मक तरीके से प्रकट करने की अनुमति देता है ।
निम्न प्रोटोकॉल माउस हाइपोथैलेमिक ऊतक में इन प्रयोगों को आयोजित करने के लिए विधि का वर्णन करता है. विशेष रूप से, हाइपोथैलेमस (PVN) के paraventricular नाभिक का कॉर्टिकोट्रॉपिन रिलीजिंग हार्मोन (CRH) न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है । हम पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के आयोजन के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन और विशिष्ट प्रयोगों synaptic बहुलता के लिए परीक्षण करने के लिए समझाओ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता स्वस्थ स्लाइसें प्राप्त कर रहा है/ हमारे वर्णित प्रोटोकॉल हाइपोथैलेमस स्लाइस कि pvn ंयूरॉंस होते है के लिए अनुकूलित है । अंय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेएस ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति प्राप्त की । W.I. मानसिक स्वास्थ्य अनुसंधान कनाडा से एक नया अंवेषक फैलोशिप प्राप्त की । यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (06106-2015 आरजीपिन) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए संस्थान (PJT १४८७०७) से डब्ल्यू मैं करने के लिए ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
