全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価
Summary
ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
中枢神経系のニューロンのペアはしばしば複数のシナプスの連絡先および/または機能神経伝達物質のリリース サイト (シナプス多重度) を形成します。シナプスの多様性は開発中とされているシナプス伝達の有効性の重要な決定要因、さまざまな生理的条件で変化とプラスチック。ここでは、我々 は終了急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して指定されたシナプス後ニューロンにシナプスの多様性の程度を推定するための実験を概説します。具体的には、自発性興奮性シナプス電流 (sEPSCs) の振幅とミニチュア興奮性シナプス電流 (mEPSCs) の違いを比較する電圧クランプ記録がされます。このメソッドの背後にある理論は、多様性を示す求心性入力は各シナプスの接触時に発生する同期のリリースのための大きい、電位依存性 sEPSCs を表示すること。対照的に、活動電位に依存しないリリース (これは非同期) 小さい振幅 mEPSCs が生成されます。この記事は一連の実験とシナプスの多様性の存在を特徴付けるための分析の概要し、要件と技術の限界について説明します。この手法は、生体に影響を与える異なった頭脳区域でシナプスの連絡先の組織でどのように異なる行動、薬理学的または環境介入を調査に適用できます。
Introduction
シナプス伝達機構はニューロン間のコミュニケーションのため、したがって、脳の機能。シナプス伝達は、不安定なも、変調信号1への応答ようにも活動に依存した方法でその効果を変更できます。したがって、シナプス機能を調べると、神経科学研究の主要な焦点がされています。全細胞パッチ クランプ電気生理学は私たちを案出する実験デザインとデータ解析によるシナプス伝達の詳細な生物物理・分子機構を理解することができる汎用性の高いテクニックです。一般的なアプローチ、おそらく技術とコンセプトのシンプルさ、ためにミニチュア興奮性/抑制性シナプス後電流の測定は (私/Ips) 電圧クランプ構成2,3,4,5,6個々 Mpsc は、それぞれ神経伝達物質シナプス前ターミナル7 から解放の結合への応答のイオン型シナプス後受容体 (例えば AMPA とギャバA受容体) を介してイオンの流れを表す。.電位依存性 Na+チャネル ブロッカー テトロドトキシン (TTX) の存在下で記録を取得するとため、リリースの活動電位非依存および通常単一シナプス小胞神経伝達物質が含まれているが含まれます。この仮定に基づいて、Mpsc の平均振幅広くとして粗見積もり素量のサイズは、数と反対のシングル リリース サイト シナプス後受容体の機能を表します。その一方で、Mpsc の周波数は、シナプス シナプス後細胞とその平均放出確率に終了の合計数の組合せを表すと見なされます。ただし、これらのパラメーターは、シナプスのシナプスの多様性別変数 multiplicativity を測定しない-シナプス伝達の有効性のために重要であります。
シナプス伝達7,8,9の量子理論に基づく、ニューロンのペア間の特定の接続の強さは 3 つの要因に依存している: 機能性シナプス (N) の数、単一シナプス小胞 (量子サイズのリリースにシナプス応答Q) および神経伝達物質のリリース (Pr) の確率。シナプスの多様性は、 Nと同じです。乗法性シナプスの刈り込みやシナプスの多様性の開発は、開発全体と別の病気の状態3,4,6,10にプラスチックです。このため、健康と病気におけるシナプス伝達の有効性を理解するための重要な含意をシナプスの多様性を特徴付けます。電子顕微鏡などの手法は、同じシナプス後ニューロン11,12、上に同じ軸索からシナプスの複数の連絡先を検出することによりシナプスの多様性の構造的な証拠を識別できます。 13,14。しかし、これらの構造的に識別された multisynapses は機能的サイレント15,16をすることができます。指定された接続は、複数の機能リリース サイトかどうかを識別することができます対の全体セルの録音などの電気生理学的アプローチを技術的に困難なNの精密機能検査が必要最小限と単一推定軸索を募集することを目指す刺激アプローチ。
このプロトコルではもともと夏ら2によって開発された方法を採用することによりシナプスの多様性を推定するための簡単な方法をについて説明します。この手法には、自発の Psc (sPSCs) ・ Mpsc 全体細胞のパッチ クランプ電気生理学、特定のニューロンに対するすべての入力間シナプスの多様性の程度を推定することができますを使用しての測定が含まれます。 以前に定義した、シナプスの多様性は、与えられた前及びシナプス後ニューロン間のシナプスの数を反映します。複数のシナプス活動電位によって同調で募集、大きい振幅 PSC を生成する個々 の (すなわち素量) Psc の時間加算の高確率になります。 MPSC 録音で (どの活動電位 TTX によってブロックされる) で個々 の (非同期) Mpsc の時間加算の確率は低い。この原理を使用して、mPSC 振幅に (活動電位依存型リリース) 用の振幅を比較することによってシナプスの多様性を推定できます。
多様性の存在を確認するには、は、4 つの実験とその解析例としてグルタミン酸作動性工を使用してについて説明します。高速の同じ方法を使用することができますただし、gaba 作動性/グリシン作動性神経伝達 (Ips)。各実験のための簡単な理論的根拠を説明します。まず、前述のように、シナプスの多様性は mEPSCs に sEPSCs の振幅を比較することによって推定できます。このアプローチの 2 つの要件があります。1) シナプス前の軸索は、録音中は、活動電位の十分な数を発火しなければならないし、複数のシナプス活動電位の到着時に神経伝達物質を解放するように、2) Prが高くなる必要があります。これらの要件を満たすために sEPSCs を最初低 Ca2 +人工髄液 (アプライド) に記録された、K+のチャネル拮抗薬 4 アミノピリジン (4 AP) を行動を高めるための低濃度存在下で記録されます。潜在的な発砲と Pr。その後、活動電位発火は TTX と電位依存性 Ca2 +チャネル ブロッカー Cd2 +減 Pr によってブロックされます。MEPSC の sEPSCs (4AP) での振幅を比較 (4AP、TTX、Cd と2 +)。2 番目の実験では、Ca2 +に置換されますモル Sr2 + desynchronize 小胞の放出にアプライドで。Ca2 +は小胞の同期のリリースに必要な Sr2 +交換多重度を示している大振幅 sEPSCs を削除してください。第三に、機械論的に、多様性起因できるいずれかの複数のシナプス連絡先同じシナプス後ニューロンまたは多胞性のリリース (すなわち複数小胞の放出単一シナプスの接触内)17,18。多様性の 2 つのタイプを区別するために第 3 実験使用低親和性、高速分離競争力の拮抗薬 AMPA 受容体 γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18大きいかどうかを決定するにはsEPSC は、独立したシナプスのシナプス後受容器の重なり人口に作用する多胞性のリリース時間の加算の結果です。多胞性のリリースから大振幅イベントが発生した場合、複数のシナプスの接触の時間の総和から生じる大規模な sEPSCs によって同様に影響されるに対し γ-DGG は大きいのより小さいのに比べて sEPSCs を抑制することで有効性が低くなりますΓ-武神。4 番目の実験より生理学的方法を使用して、活動電位発火、すなわち求心性のシナプス刺激を強化します。シナプスのバーストは、刺激の求心性神経の自発性活動電位発火と放出確率を促進/増加できる一過性。したがって、このアプローチはより生理的な方法でマニフェストに多様性をことができます。
次のプロトコルは、マウス視床下部組織のこれらの実験を行う方法を説明します。具体的には、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH) (PVN) 視床下部の室傍核ニューロンが使用されます。全体細胞のパッチ クランプ電気生理学を実施するための手順について説明し、シナプスの多様性をテストする特定の実験を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功したパッチ クランプ電気生理学実験のための重要な要件の 1 つが健康的なスライス/セルを取得します。ご説明されているプロトコルは、PVN ニューロンを含む視床下部のスライスに最適です。他の脳領域が必要があります変更・ スライス方法21,22,23,24。録音だけ膜抵抗などセルのプロパティ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. s. は、オンタリオ州の大学院の奨学金を受け取った。ウィスコンシン. は、精神的な健康の研究のカナダから新しい研究者フェローシップを受けた。この作品は、健康の研究 (PJT 148707) 自然科学と工学研究会のカナダ (06106-2015 RGPIN) およびカナダの研究所から W.I に運営費交付金によってサポートされます。
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
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