Оценка синаптических кратности, используя поклеточного патч зажим электрофизиологии
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки функциональных синаптических кратности, используя патч поклеточного зажим электрофизиологии острого мозга ломтиками.
Abstract
В центральной нервной системе пара нейронов часто образуют несколько синаптических контактов и/или функциональных нейромедиатора релиз сайтов (синаптических кратности). Синаптических многообразие является пластика и изменения на протяжении развития и различных физиологических условиях, будучи важным определяющим фактором эффективности синаптической передачи. Здесь мы приводим экспериментов для оценки степени кратности синапсы, прекращения на данной постсинаптических нейрон, используя патч поклеточного зажим электрофизиологии острого мозга ломтиками. В частности мембраной запись используется для сравнения разницы между амплитуда спонтанное возбуждающих постсинаптических токов (sEPSCs) и миниатюрные возбуждающих постсинаптических токов (mEPSCs). Теория позади этот метод является, что афферентные входов, которые демонстрируют многообразие покажет большой, потенциал действия зависимой sEPSCs благодаря синхронного выхода, что происходит на каждом синаптического контакта. В отличие от этого потенциал действия независимый релиз (которая является асинхронным) будет генерировать меньше амплитуда mEPSCs. Эта статья рассматривается ряд экспериментов и анализа характеризовать существование синаптических кратности и требования и ограничения метода. Этот метод может быть применен к расследованию как различные поведенческие, фармакологическим или экологических мероприятий в vivo влияют на организацию синаптических контактов в областях различных мозга.
Introduction
Синаптической передачи является основным механизмом для связи между нейронами и следовательно, мозга функции. Синаптической передачи также лабильных и может изменить его эффективности на основе зависящих от деятельности, а также ответ модулирующее сигналы1. Таким образом рассмотрение синаптического функция был ключевым направлением исследований неврологии. Патч поклеточного зажим электрофизиологии — это универсальный метод, который позволяет нам понять, разработки экспериментальных проектов и анализ данных, углубленные биофизические и молекулярные механизмы синаптической передачи. Часто используемый подход, возможно благодаря простоте технику и концепции, является измерение миниатюрные возбуждающим/тормозной постсинаптический токов (mE / IPSCs) под напряжением зажим конфигурации2,3, 4 , 5 , 6. отдельные mPSCs представляют поток ионов через ИОНОТРОПНЫХ постсинаптических рецепторов (например, АМПА и ГАМК-А рецепторов) в ответ на привязку их соответствующих нейротрансмиттеров, выпустила Пресинаптический терминала 7 . Поскольку запись получается при наличии напряжения закрытый Na+ канала блокатор Тетродотоксин (TTX), потенциал действия независимые и выпуска обычно включает один синаптических пузырьков, содержащий нейромедиатора. Основываясь на этом предположении, средняя амплитуда mPSCs широко используется как сырой смету для квантильного размер, который представляет количество и функциональность постсинаптических рецепторов, против сайта сингл. С другой стороны частота mPSCs, как считается, представляют собой сочетание общего числа синапсов, прекращения на постсинаптической клетке и вероятность их средняя выпуска. Однако, эти параметры не измеряют другой переменной мультипликативность синапсы, или синаптических кратности, которая имеет важное значение для эффективности синаптической передачи.
Основываясь на квантильного теории синаптической передачи7,8,9, сила данного соединения между парой нейронов зависит от трех факторов: количество функциональных синапсов (N), постсинаптического ответа на выпуск одного синаптических пузырьков (квантовый размер; Q) и вероятность нейромедиатора релиз (P-r). Синаптических кратности эквивалентен N. Развитию синаптических кратности или обрезка мультипликативной синапсы — пластик на протяжении развития и различные болезни государства3,4,6,10. По этой причине характеризующие синаптических кратность имеет важные последствия для понимания эффективности синаптической передачи в здоровье и болезни. Методы, такие как электронная микроскопия можно определить структурные доказательства синаптических кратности, обнаружение нескольких синаптических контактов, возникая от же аксон на же постсинаптических нейронов11,12, 13,14. Однако эти структурно определенных multisynapses может быть функционально немого15,16. Точное функциональные обследования N требует технически сложных электрофизиологических подходы, такие как парные поклеточного записей, которые можно определить ли данного соединения имеет несколько функциональных релиз сайтов и минимальным стимуляция подходы, которые стремятся нанимать одного предполагаемого аксон.
В этом протоколе мы опишем простой метод для оценки синаптических кратности, приняв метод, первоначально разработанный Hsia et al2. Этот метод предполагает измерение спонтанного Чок (sPSCs) и mPSCs с помощью зажима электрофизиологии поклеточного патч, который позволяет нам оценить степень синаптических многообразие во всех материалов для данного нейрона. Как ранее определенных, синаптических кратности отражает количество синапсов между данной предварительной и постсинаптических нейрона. Если несколько синапсы набираются в синхронности действий потенциал, будет высокой вероятностью височной суммирование отдельных (т.е. квантильного) Чок, создавая большую амплитуду PSC. В записях mPSC (в котором потенциалы действия блокируются TTX), низка вероятность временной суммирование отдельных (не синхронный) mPSCs. Используя это обоснование, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды СКТУ (с релиз действий потенциал зависимых) mPSC амплитуде.
Чтобы проверить существование множества мы описываем четырех экспериментов и их анализа с использованием глутаматергические EPSCs качестве примера. Однако, такой же подход может использоваться для быстрой передачи ГАМК/glycinergic (IPSCs). Ниже приводится краткое обоснование каждого эксперимента. Во-первых как объяснялось выше, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды sEPSCs к mEPSCs. Существуют два требования для этого подхода; 1) Пресинаптический аксоны должен стрелять достаточное количество потенциалы действия во время записи, и 2) Pr должны быть высокой, так что несколько синапсы освобождение нейромедиатора по прибытии потенциал действия. Чтобы соответствовать этим требованиям, sEPSCs сначала записываются в низкой Ca2 + искусственный спинномозговой жидкости (ФАГО) и затем записал присутствии низкой концентрации антагонистов канал K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) для увеличения действий Prи потенциальные увольнения. Затем огонь потенциал действия заблокирован TTX и Pr, снизился на закрытом напряжения Ca2 + канала блокатор Cd2 +. Амплитуда sEPSCs (с 4AP) по сравнению с mEPSC (с 4AP, TTX и Cd2 +). Во втором эксперименте Ca2 + заменяется эквимолярных Sr2 + в фаго десинхронизироваться везикул выпуска. Как Ca2 + требуется для синхронный выпуске везикулы, замена с Sr2 + следует устранить sEPSCs большой амплитуды, которая свидетельствует о множественности. В-третьих, механически, многообразие может быть результатом либо несколько синаптических контактов же постсинаптических нейронов или multivesicular выпуска (то есть несколько везикулы, выпущенные в течение одного синаптического контакта)17,18. Проводить различие между двумя типами кратности, третий эксперимент использует низкого сродства, быстро разъединять конкурентным антагонистом рецепторов АМПА, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , чтобы определить, является ли большой sEPSC являются результатом временной суммирование независимых синапсов или multivesicular релиз, действуя на перекрывающихся населения постсинаптических рецепторов. Если большой амплитуды события вытекают из multivesicular выпуска, γ-DGG будет менее эффективным в ингибирующих больше по сравнению с небольших sEPSCs, тогда как большой sEPSCs, которые возникают от височной суммирование нескольких синаптических контактов будут аналогичным образом затронуты Γ-DGG. В четвертом эксперимент более физиологический метод используется для повысить потенциал действия стрельбы, а именно афферентных синаптических стимуляции. Всплесков синаптической активности может временно увеличить/облегчить самопроизвольно потенциал действия стрельбы и выпуска вероятность стимулировали афферентов. Таким образом этот подход позволяет кратности проявляться в более физиологическим способом.
Следующий протокол описывает метод для проведения этих экспериментов в мыши гипоталамуса ткани. В частности используются АКТГ выпуская инкреть (ЦРБ) нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВН). Мы описывать процедуры для проведения поклеточного патч зажим электрофизиологии и объяснить конкретные эксперименты для проверки синаптических кратности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одно из важных требований для успешного патч зажим электрофизиологии эксперимента является получение здоровых фрагменты/клеток. Наши описывается протокол оптимизирован для гипоталамуса фрагментов, которые содержат PVN нейронов. Другие мозга, которая районах может потребоваться изме?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
И.с. получил стипендию аспирантов Онтарио. Новый следователь стипендии от психического здоровья исследований Канады получил В.И. Эта работа поддерживается операционной гранты для W.I от естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (06106-2015 RGPIN) и в Канадский институт медицинских исследований (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
