Die Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung mit Detect Multimerischen Komplexen, die durch Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture stabilisiert wurden
Summary
Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. Eine einfache Methode, um multimerische Komplexe zu analysieren, die durch diese Verknüpfungen stabilisiert werden, ist die Nicht-Remation der SDS-PAGE-Analyse. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS veranschaulicht.
Abstract
Die Strukturen vieler Proteine werden durch kovalente disulfide Verbindungen stabilisiert. In den jüngsten Arbeiten wurde diese Anleihe auch als nachträgliche Modifikation eingestuft. Daher ist es wichtig, diese Veränderung in lebenden Zellen studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten Multimerenkomplexe zu analysieren, ist eine zweistufige Methode, die SDS-PAGE-Analyse und Formaldehyd-Vernetzung nicht zu reduzieren. Diese zweistufige Methode ist als erster Schritt zur Aufdeckung von multimerischen Komplexen vorteilhaft, die durch disulfide Verbindungen aufgrund ihrer technischen Leichtigkeit und niedrigen Betriebskosten stabilisiert werden. Hier wird die menschliche Knochenosteosarkomat-Zelllinie U-2 OS verwendet, um diese Methode zu illustrieren, indem sie die nukleare Isoform von DUTPase gezielt analysiert.
Introduction
Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. In jüngster Zeit wurde diese Bindung auch als eine resible post-translationale Modifikation klassifiziert und fungiert als ein auf Zylinder basierender “Redox-Schalter,” der die Modulation von Proteinfunktion, Lage und Interaktion 1, 2 ermöglicht. 3,4. Daher ist es wichtig, diese Modifikation studieren zu können. Eine einfache Methode, um diese cysteinstabilisierten multimerischen Komplexe zu analysieren, ist die Nicht-Rindung der SDS-PAGE-Analyse5. SDS-PAGE-Analyse ist eine Technik, die in vielen Labors verwendet wird, wo die Ergebnisse schnell, einfach und mit minimalen Kosten gewonnen und interpretiert werden können, und ist vorteilhaft gegenüber anderen Techniken, die verwendet werden, um disulfide Verbindungen wie Massenspektrometrie 6 zu identifizieren. ,7 und kreisförmig dichroistisch8.
Ein wichtiger Schritt bei der Bestimmung, ob diese Methode eine geeignete Technik ist, um in einer Studie zu helfen, ist es, die primäre Abfolge des Proteins von Interesse, um sicherzustellen, dass es Cystein-Rückstände (s) vorhanden sind gründlich zu untersuchen. Ein weiterer hilfreicher Schritt ist es, alle bisherigen Kristallstrukturen zu erforschen oder eine Bioinformatik-Anwendung zu verwenden, um die dreidimensionale Struktur des Proteins von Interesse zu erforschen, um zu visualisieren, wo sich die Cystein-Rückstände befinden können. Wenn die Rückstände auf der Außenfläche vorhanden sind, kann es ein besserer Kandidat sein, eine disulfide Verbindung zu bilden, anstatt einen Cystein-Rückstand, der auf der Innenseite der Struktur vergraben ist. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass Proteine strukturelle Veränderungen bei Substratinteraktionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen durchlaufen können, so dass diese Rückstände dann auch der Umwelt ausgesetzt werden.
Identifizierte multimerische Komplexe können dann mit Hilfe chemischer Vernetzung mit Formaldehyd überprüft werden. Formaldehyd ist aufgrund der hohen Zelldurchlässigkeit und der kurzen Vernetzungsspanne von ~ 2-3, ein idealer Cross-Linker für diese Verifikationstechnik, der die Erkennung spezifischerProteinproteininteraktionen 9,10 gewährleistet. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS 11 veranschaulicht. Dieses Protokoll kann jedoch auch für andere Zelllinien, Gewebe und Organismen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier skizzierte Methode gibt ein Straight-Forward-Protokoll für die Analyse von multimären Komplexen, die durch disulfide Verbindungen stabilisiert werden. Dieses Protokoll lässt sich leicht an andere Zellkulturlinien, Gewebe und Organismen anpassen, die eine breite Palette von Anwendungen ermöglichen.
Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist es, sicherzustellen, dass die Disulfid-Verbindungen keine Folge des Absaugverfahrens sind. Alle freien Cystein-Rückstände können mit Iodo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir freuen uns über die Bemühungen von Dr. Jennifer Fischer für die Reinigung des dUTPase polyklonalen Antikörpers und Kerri Ciccaglione für all ihre Bemühungen, dieses Manuskript zu bearbeiten. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Stipendium der New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18) unterstützt.
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
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