Summary

Combinación de análisis de SDS-página no-reducción y reticulación química para detectar complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro en células de mamíferos en la cultura

Published: May 02, 2019
doi:

Summary

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. Un método simple para analizar complejos multiméricos estabilizados por estos vínculos es mediante el análisis de SDS-PAGE no reductor. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células de osteosarcoma ósea humana U-2 OS.

Abstract

Las estructuras de muchas proteínas se estabilizan a través de enlaces de disulfuro covalente. En los trabajos recientes, este vínculo también se ha clasificado como una modificación post-translacional. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación en las células vivas. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de un método de dos pasos de no reducir el análisis de SDS-PAGE y la reticulación de formaldehído. Este método de dos pasos es ventajoso como el primer paso para descubrir complejos multiméricos estabilizados por enlaces de disulfuro debido a su facilidad técnica y bajo costo de operación. Aquí, la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS se utiliza para ilustrar este método mediante el análisis específico de la isoforma nuclear de dUTPase.

Introduction

Durante mucho tiempo se ha sabido que los vínculos de disulfuro estabilizan la estructura de muchas proteínas. En los trabajos recientes, este lazo también se ha clasificado como una modificación post-translacional reversible, actuando como un “interruptor redox” basado en la cisteína que permite la modulación de la función de la proteína, ubicación e interacción1,2, 3,4. Por lo tanto, es importante poder estudiar esta modificación. Un método simple para analizar estos complejos multiméricos de la cisteína estabilizada es a través de análisis de SDS-PAGE no-reducción5. El análisis de SDS-PAGE es una técnica utilizada en muchos laboratorios, donde los resultados se pueden obtener e interpretar de forma rápida, fácil y con costos mínimos, y es ventajoso sobre otras técnicas utilizadas para identificar enlaces de disulfuro como la espectrometría de masas6 ,7 y dicroísmo circular8.

Un paso importante para determinar si este método es una técnica apropiada para ayudar en un estudio es examinar a fondo la secuencia primaria de la proteína de interés para asegurar que hay residuos de cisteína presentes. Otro paso útil es investigar cualquier estructura cristalina anterior publicada o utilizar una aplicación de bioinformática para explorar las tres estructuras dimensionales de la proteína de interés para visualizar donde pueden estar localizados los residuos de cisteína. Si el residuo (s) está presente en la superficie exterior puede ser un mejor candidato para formar un enlace de disulfuro en lugar de un residuo de cisteína enterrado en el interior de la estructura. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las proteínas pueden someterse a cambios estructurales en las interacciones de sustrato o interacciones proteína-proteína permitiendo que estos residuos a continuación, se exponen al medio ambiente, así.

Los complejos multiméricos identificados se pueden verificar con la reticulación química utilizando formaldehído. El formaldehído es un enlace cruzado ideal para esta técnica de verificación debido a la alta permeabilidad de las células y a la corta distancia cruzada de ~ 2-3 Å, asegurando la detección de interacciones proteína-proteína específicas9,10. Aquí, este método se ilustra mediante el análisis de la isoforma nuclear de dUTPase de la línea de células osteosarcoma ósea humana U-2 OS11. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado para otras líneas celulares, tejidos y organismos.

Protocol

1. bloqueo de residuos de cisteína libre usando Iodoacetamida Crecer células U-2 OS en un 6 cm2 plato a 50% – 60% confluencia en medio esencial mínimo con alta glucosa que contiene 10% suero bovino fetal y 1% piruvato sódico a 37 ° c en 5% Co2. Haga un caldo fresco de iodoacetamida de 10 mM justo antes de su uso, luego deseche cualquier reactivo no utilizado. Añadir 0,1 mM de concentración final iodoacetamida directamente al medio de cultivo celular. Rocía sua…

Representative Results

Nuclear dUTPase forma un varillaje de disulfuro intermoleculares formando una configuración de dímero estable a través de la interacción de dos residuos de cisteína colocados en el tercer aminoácido de cada proteína monomérica11. Esto se demuestra en la figura 1A, B. Para garantizar que esta vinculación de disulfuro no era una interacción no específica debido a anomalías en la migración en el entorno no re…

Discussion

El método descrito aquí da un protocolo recto para el análisis de complejos multiméricos estabilizados a través de enlaces de disulfuro. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras líneas de cultivo celular, tejidos y organismos que permiten una amplia gama de aplicaciones.

Un paso importante en este procedimiento es garantizar que los enlaces de disulfuro no sean una consecuencia del procedimiento de extracción. Cualquier residuo de cisteína libre puede ser bloqueado usando io…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos gratamente los esfuerzos realizados por la Dra. Jennifer Fischer para la purificación del anticuerpo policlonales de dUTPase y Kerri ciccaglione por todos sus esfuerzos para ayudar a editar este manuscrito. Esta investigación fue apoyada parcialmente por una subvención de la Fundación de salud de Nueva Jersey (Grant #PC 11-18).

Materials

16% precast TGX gels ThermoFisher Xp00160
175 cm2 Flask Cell star 658175
18CO ATCC CRL-1459
6 cm2 dish VWR 10861-588
A549 ATCC CCL-185
Amersham ECL detection kit GE 16817200
Blot transfer apparatus Biorad 153BR76789
BME Sigma Aldrich M3148
Bradford protein reagent Biorad 5000006
Bromophenol Blue
BSA Cell signaling 99985
Cell lysis buffer Cell signaling 9803
Centrifuge Eppendor 5415D
DMEM Gibco 11330-032
Drill
EDTA Sigma Aldrich M101
Electrophoresis apparatus Invitrogen A25977
Extra thick western blotting paper ThermoFisher 88610
Fetal bovine serum Gibco 1932693
Formaldehyde ThermoFisher 28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol Sigma Aldrich 65516
Glycine RPI 636050
Heat block Denville 10285-D
Hepes Sigma Aldrich H0527
Hydrochloric acid VWR 2018010431
Iodoacetamide ThermoFisher 90034
Kimwipe Kimtech 34155
Methanol Pharmco 339000000
Non-fat dry milk Cell signaling 99995
PBS Sigma Aldrich P3813
PMSF Sigma Aldrich 329-98-6
Posi-click tube Denville C2170
Power supply Biorad 200120
Prestained marker ThermoFisher 26619
PVDF membrane Biorad 162-0177
Rocker Reliable Scientific 55
Saos2 ATCC HTB-85
SDS Biorad 161-0302
Secondary antibody Cell signaling 70748
Small cell scraper Tygon S-50HL class VI
Sodium chloride RPI S23020
Sodium pyruvate Gibco
Sonicator Branson 450
Sponge pad for blotting Invitrogen E19051
Stir plate Corning PC353
Sucrose Sigma Aldrich S-1888
Tris Base RPI T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 Sigma Aldrich SRE0031
Tris-Glycine running buffer VWR J61006
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
U-2 OS ATCC HTB-96
X-ray film ThermoFisher 34090

References

  1. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  2. Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
  3. Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
  4. Groitl, B., Jakob, U. Thiol-based redox switches. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).
  5. Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
  6. Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
  7. Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
  8. Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  9. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
  10. Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
  11. Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
  12. Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
  13. Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
  14. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).

Play Video

Cite This Article
Rotoli, S. M., Caradonna, S. J. Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture. J. Vis. Exp. (147), e59483, doi:10.3791/59483 (2019).

View Video