Un modèle de xénogreffe dérivé du mélanome

Summary

Les modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient récapitulent plus solidement les caractéristiques moléculaires et biologiques du mélanome et sont plus prédictifs de la réponse thérapeutique par rapport aux essais traditionnels fondés sur la culture des tissus plastiques. Nous décrivons ici notre protocole d’exploitation standard pour l’établissement de nouveaux modèles PDX et la caractérisation/expérimentation des modèles PDX existants.

Abstract

L’accumulation des preuves suggère que les propriétés moléculaires et biologiques diffèrent dans les cellules de mélanome cultivées dans les vaisseaux traditionnels de culture de tissu bidimensionnels contre in vivo dans les patients humains. Ceci est dû à la sélection de goulot d’étranglement des populations clonales des cellules de mélanome qui peuvent fortement se développer in vitro en l’absence de conditions physiologiques. De plus, les réponses à la thérapie dans les cultures tissulaires bidimensionnelles dans l’ensemble ne reflètent pas fidèlement les réponses à la thérapie chez les patients atteints de mélanome, la majorité des essais cliniques ne démontportant pas l’efficacité des combinaisons thérapeutiques qui se sont avérées efficaces dans Vitro. Bien que le xénogreffedes de cellules de mélanome chez la souris fournit le contexte physiologique in vivo absent des essais bidimensionnels de culture de tissu, les cellules de mélanome employées pour l’engraftment ont déjà subi la sélection de goulot d’étranglement pour des cellules qui pourraient se développer sous conditions bidimensionnelles lorsque la lignée cellulaire a été établie. Les modifications irréversibles qui se produisent à la suite du goulot d’étranglement comprennent des changements dans les propriétés de croissance et d’invasion, ainsi que la perte de sous-populations spécifiques. Par conséquent, les modèles qui récapitulent mieux la condition humaine in vivo peuvent mieux prévoir des stratégies thérapeutiques qui augmentent effectivement la survie globale des patients présentant le mélanome métastatique. La technique de xénogreffe (PDX) dérivée du patient implique l’implantation directe des cellules de tumeur du patient humain à un destinataire de souris. De cette manière, les cellules de tumeur sont uniformément cultivées sous des contraintes physiologiques in vivo et ne subissent jamais le goulot d’étranglement bidimensionnel, qui préserve les propriétés moléculaires et biologiques présentes quand la tumeur était dans le patient humain. Notable, les modèles PDX dérivés de sites d’organes de métastases (c.-à-d. le cerveau) présentent une capacité métastatique similaire, tandis que les modèles PDX dérivés de patients naïfs et de patients ayant une résistance acquise à la thérapie (c.-à-d. la thérapie inhibitrice BRAF/MEK) présentent un affichage sensibilité similaire à la thérapie.

Introduction

Les modèles précliniques sont essentiels pour tous les aspects de la recherche translationnelle sur le cancer, y compris la caractérisation des maladies, la découverte de vulnérabilités exploitables propres au cancer par rapport aux cellules normales, et le développement de thérapies efficaces qui exploitent ces vulnérabilités pour augmenter la survie globale des patients. Dans le domaine du mélanome, des dizaines de milliers de modèles de lignées cellulaires ont été fortement utilisés pour le dépistage des médicaments, avec 4 000 euros de contribution de notre seul groupe (série WMXXX). Ces modèles de lignée cellulaire ont été dérivés de patients atteints de mélanome présentant diverses formes de mélanome cutané (c.-à-d. la propagation acraleuse, uveale et superficielle) et de divers génotypes (c.-à-d., BRAF^V600-mutant et neuroblastome RAS viral oncogene homolog [ NRAS (En) ^Q61R-mutant]), qui couvrent le spectre de la maladie présente dans la clinique^1,2.

Sans équivoque, la stratégie thérapeutique la plus réussie et ciblée dans le domaine du mélanome est née de 1) la caractérisation génomique des tumeurs des patients identifiant les mutations BRAF dans 50% des mélanomes³ et de 2) l’enquête préclinique tirant parti des modèles de lignée cellulaire du mélanome⁴. La combinaison d’inhibiteurs BRAF/MEK a été approuvée en 2014 par la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement des patients dont les mélanomes abritent l’activation des mutations BRAF^V600E/K et bénéficie d’un taux de réponse^{de 5}. Malgré cette efficacité initiale, la résistance surgit rapidement dans presque tous les cas en raison des mécanismes intrinsèques et acquis multiples de résistance et de l’hétérogénéité intratumorale. Malheureusement, les modèles de lignées cellulaires ne récapitulent pas l’hétérogénéité biologique représentative lorsqu’ils sont cultivés dans une culture bidimensionnelle dans des récipients en plastique, ce qui masque leur potentiel cliniquement prédictif lorsque les chercheurs tentent de déterminer expérimentalement thérapies qui pourraient être efficaces chez les patients présentant une forme spécifique ou un génotype du mélanome⁶. Comprendre comment modéliser au mieux l’hétérogénéité intratumorale du patient permettra aux chercheurs de mieux développer des modalités thérapeutiques qui peuvent tuer les sous-populations résistantes à la thérapie qui entraînent l’échec aux thérapies actuelles de norme de soins.

La valeur prédictive limitée des modèles de lignées cellulaires est la façon dont ils sont initialement établis. Des altérations irréversibles se produisent dans le paysage clonal de tumeur quand une suspension unicellulaire d’une tumeur de patients est cultivée sur les navires bidimensionnels et de culture de tissu plastique, y compris des changements dans le potentiel proliférant et invasif, l’élimination de spécifique sous-populations, et l’altération de l’information génétique⁷. Les xénogreffes chez les souris de ces modèles de lignée cellulaire de mélanome représentent la plate-forme in vivo la plus fréquemment utilisée pour les études précliniques ; cependant, cette stratégie souffre également de la récapitulation pauvre de l’hétérogénéité complexe de tumeur observée médicalement. Pour surmonter cette lacune, il y a eu un intérêt croissant dans l’incorporation des modèles précliniques plus sophistiqués du mélanome, y compris le modèle de PDX. Les modèles de PDX ont été utilisés pendant 30 ans, avec des études séminales dans les patients de cancer du poumon démontrant la concordance entre la réponse des patients aux agents cytotoxiques et la réponse du modèle de PDX dérivé du même patient⁸. Récemment, il ya eu une volonté d’utiliser des modèles PDX comme l’outil de choix pour les enquêtes précliniques à la fois dans l’industrie et dans les centres universitaires. Les modèles de PDX, en raison de leur récapitulation supérieure de l’hétérogénéité de tumeur dans les patients humains, sont plus médicalement pertinents à employer dans des efforts d’optimisation de thérapie que les xénogreffes^deligne cellulaire 9. Dans le mélanome, il y a d’immenses obstacles qui émoussent la gestion thérapeutique de la maladie avancée¹⁰. Des modèles De PDX cliniquement pertinents ont été utilisés pour modéliser la résistance clinique et identifier des stratégies thérapeutiques avec des agents cliniquement disponibles pour traiter les tumeurs résistantes à la thérapie^11,12. En bref, le protocole présenté ici pour générer des modèles de PDX exige l’implantation sous-cutanée de tissu frais des mélanomes primaires ou métastatiques (recueillis par biopsie ou chirurgie) dans les souris nulles de NOD/scid/IL2-récepteur (NSG). Différentes variations de l’approche méthodologique sont utilisées par différents groupes; cependant, un noyau fondamental existe¹³.

Protocol

Les protocoles animaux suivants suivent les lignes directrices du comité d’éthique des animaux de l’Institut Wistar et les lignes directrices sur les soins aux animaux. 1. Collection de tissu de tumeur de mélanome Recueillir le tissu tumoral (appelé passage 0) des patients de mélanome par l’une des méthodes suivantes de chirurgie ou de biopsie. Pour les tissus d’excision chirurgicale, maintenir un minimum de 1 g de tissu (métastases et lésions primaires) dans les mili…

Representative Results

Le tissu tumoral pour les modèles de mélanome PDX peut provenir d’une variété de différentes sources et peut également être traité par la dynamique de croissance des modèles individuels et l’utilisation désirée du tissu DeX. La priorité lors de l’établissement d’un modèle PDX est d’avoir suffisamment de matériel pour la banque pour une utilisation future et l’ADN pour la caractérisation (figure 1). Une fois que le matériel suffisant est mis en ban…

Discussion

Nous avons décrit ici générant des modèles de PDX du mélanome avec le tissu patient dérivé des tumeurs primaires et métastatiques, des biopsies de noyau, et des FNAs. Lorsqu’elles sont directement greffées chez des souris DeNS, les tumeurs présentent des propriétés morphologiques, génomiques et biologiques similaires à celles observées chez le patient. Dans le cas où seulement une petite quantité de tissu est disponible pour les investigateurs, comme cela se produit souvent avec des FNA, la technique de …

Materials

1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631