Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo
Summary
Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Patologia della malattia a causa di TBI progredisce dall’insulto meccanico primario ai processi di lesioni secondarie, tra cui apoptosi e infiammazione. La modellazione animale è stata preziosa nella ricerca di svelare i meccanismi di lesione e valutare potenziali terapie neuroprotettive. Questo protocollo descrive il modello di impatto corticale controllato (CCI) del TBI focale e a testa aperta. In particolare, vengono descritti i parametri per produrre una lieve lesione corticale unilaterale. Le conseguenze comportamentali del CCI vengono analizzate utilizzando il test di rimozione del nastro adesivo dell’integrazione sensoriale-continua bilaterale. Per quanto riguarda la terapia sperimentale per la patologia TBI, questo protocollo illustra anche un processo per il trapianto di cellule coltivate nel cervello. Le colture di cellule neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC) sono state scelte per il loro potenziale per mostrare un ripristino funzionale superiore nei pazienti con TBI umana. La sopravvivenza cronica degli hiPSC nel tessuto cerebrale del topo ospite viene rilevata utilizzando un processo immunohistochimico DAB modificato.
Introduction
Lesione cerebrale traumatica (TBI) è un termine generale per la lesione acquisita al cervello a causa di forze meccaniche indirette (accelerazione/decelerazione rotazionale o contro-colpo) da colpi alla testa o danni diretti da oggetti o onde di scoppio. La TBI è stata stimata essere la causa di circa il 9% dei decessi a livello mondiale e osservata in circa 50 milioni di casi all’anno1,2. Un rapporto del 2017 dei Centers for Disease Control and Prevention ha stimato che nel 2013 ci sono stati 2,8 milioni di visite ospedaliere e decessi dovuti a TBI negli Stati Uniti3. Molti TBI più lievi non vengono segnalati ogni anno. La TBI grave può portare a una compromissione permanente della cognizione, della funzione motoria e della qualità generale della vita. Le conseguenze del lieve TBI, in particolare il TBI sportivo ripetitivo, sono state apprezzate solo di recente per i loro insidiosi effetti sulla salute4,5.
La modellazione preclinica è una componente vitale dello sviluppo di nuove intuizioni meccanicistiche e di una potenziale terapia rigenerativa per la TBI. Il modello a impatto corticale controllato (CCI) di TBI è un modello a testa aperta di lesioni da contusione meccanica alla corteccia. I parametri di impatto possono essere modificati per produrre lesioni CCI che vanno da lievi a6. Le lesioni CCI sono focali piuttosto che diffuse, come si è visto con altri modelli a testa chiusa di TBI. CCI può essere eseguito per indurre una lesione unilaterale, in modo tale che la corteccia contralaterale può servire come un comparatore interno. Questo protocollo dimostra le caratteristiche di un CCI lieve a una porzione della corteccia che comprende le regioni somatosensoriali e motorie primarie. Questa zona corticale è stata scelta per il suo coinvolgimento nei comportamenti sensomotori per i quali numerosi test di comportamento possono rilevare deficit indotti da lesioni7. Miglioramenti comportamentali dovuti a interventi terapeutici per la TBI possono essere rilevati, pure.
Un segno distintivo della TBI è diffusa disfunzione neurale nella regione ferita. I neuroni feriti subiscono la morte cellulare, e la connettività della rete neuronale viene interrotta8,9. La TBI interrompe il reclutamento di cellule staminali endogene, il che porta a ulteriori deficit di comportamento a valle10,11. Il trapianto di cellule staminali neurali e cellule derivate da cellule staminali è stato esplorato come una possibilità per ripristinare la funzione nel cervello ferito. Oltre al potenziale per ripristinare i circuiti neurali danneggiati, le cellule trapiantate esercitano effetti paracrini che promuovono la sopravvivenza neuronale e il recupero funzionale da TBI12. Una varietà di tipi di cellule sono stati trapiantati preclinicamente per valutare il loro potenziale rigenerativo in modelli di disturbi neurologici13,14,15. La recente divulgazione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotta16 ha facilitato lo sviluppo di numerose linee di cellule staminali umane per uso sperimentale. Il test preclinico con cellule derivate da hiPSC è un primo passo importante per caratterizzare la potenziale efficacia terapeutica di una data linea cellulare contro le malattie umane. Questo laboratorio ha sviluppato protocolli per differenziare gli hiPSC ai fenotipi neurali17 alla ricerca di cellule trapiantate per aiutare il recupero da lesioni cerebrali traumatiche.
Gli esperimenti in questo protocollo utilizzano un CCI unilaterale per indurre la TBI alla corteccia somatosensoriale e motoria sinistra dei topi adulti. Una lieve lesione CCI si traduce in un deficit funzionale sostenuto nella pedina destra che viene utilizzato per monitorare gli effetti dell’innesto di cellule neurali derivato da hiPSC sul recupero funzionale. Il forepaw sensorimotor testing in questo protocollo è stato adattato dalla metodologia stabilita da Bouet e colleghi18 e dimostrato in precedenza da Fleming e colleghi19. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo per l’esecuzione di una lesione cerebrale sperimentale, il trapianto terapeutico di cellule hiPS e l’analisi comportamentale e istologica delle misure di esito sperimentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCI mite come sistema modello per testare la terapia rigenerativa sperimentale
Il modello CCI è uno strumento prezioso per studiare i meccanismi di disfunzione tissutale dopo lesioni meccaniche alla corteccia. La sintonabilità dei parametri di lesione è una caratteristica interessante di questo modello. Alterare la profondità di impatto, la velocità o il tempo di dimora può aumentare o diminuire la gravità della lesione come desiderato dall’investigatore10,<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numero di sovvenzione G170244014). Apprezziamo l’assistenza di Mahima Dewan e Clara Selbrede negli studi pilota di rimozione adesiva. Kryslaine Radomski ha eseguito interventi chirurgici preliminari per il trapianto di cervello e trapianto di cellule. Amanda Fu e Laura Tucker del laboratorio centrale USU CNRM Preclinical Studies hanno fornito preziosi consigli rispettivamente su interventi chirurgici e test di comportamento per animali.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
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