Modelo de impacto cortical controlado de lesión cerebral de ratón con trasplante terapéutico de células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre
Summary
Este protocolo demuestra metodologías para un modelo de ratón de lesión cerebral traumática de cráneo abierto y trasplante de células pluripotentes derivadas de células madre inducidas por el ser humano cultivadas en el sitio de la lesión. Las pruebas conductuales y histológicas de los resultados de estos procedimientos también se describen brevemente.
Abstract
La lesión cerebral traumática es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La patología de la enfermedad debido a tAT progresa desde el insulto mecánico primario hasta los procesos de lesiones secundarias, incluyendo la apoptosis y la inflamación. El modelado animal ha sido valioso en la búsqueda para desentrañar los mecanismos de lesión y evaluar posibles terapias neuroprotectoras. Este protocolo describe el modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI focal y de cabeza abierta. Específicamente, se describen los parámetros para producir una lesión cortical unilateral leve. Las consecuencias conductuales de CCI se analizan utilizando la prueba de eliminación de cinta adhesiva de la integración sensorimotor bilateral. En cuanto a la terapia experimental para la patología TBI, este protocolo también ilustra un proceso para trasplantar células cultivadas en el cerebro. Los cultivos celulares neuronales derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) fueron elegidos por su potencial para mostrar una restauración funcional superior en pacientes tBI humanos. La supervivencia crónica de los hiPSC en el tejido cerebral del ratón huésped se detecta mediante un proceso inmunohistoquímico DAB modificado.
Introduction
Lesión cerebral traumática (TBI) es un término general para la lesión adquirida en el cerebro debido a fuerzas mecánicas indirectas (aceleración/desaceleración rotacional o contragolpe) de golpes en la cabeza o daño directo de objetos o ondas explosivas. Se ha estimado que el TBI es la causa de aproximadamente el 9% de las muertes en todo el mundo y se ha observado en unos 50 millones de casos por año1,2. Un informe de 2017 de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades estimó que en 2013 hubo un total de 2,8 millones de visitas hospitalarias y muertes debidas a TBI en los Estados Unidos3. Muchos TMI más leves no se notifican cada año. El TBI grave puede conducir a un deterioro de por vida de la cognición, la función motora y la calidad de vida general. Las consecuencias de la TBI suave, especialmente tBI repetitivo relacionado con el deporte, han sido apreciadas recientemente por sus insidiosos efectos sobre la salud4,5.
El modelado preclínico es un componente vital del desarrollo de nuevos conocimientos mecanicistas y una posible terapia restauradora para la TBI. El modelo de impacto cortical controlado (CCI) de TBI es un modelo de cabeza abierta de lesión por contusión mecánica en la corteza. Los parámetros de impacto se pueden modificar para producir lesiones de CCI que van de leves a graves6. Las lesiones de CCI son focales más que difusas, como se ve con otros modelos de cabeza cerrada de TBI. EL CCI se puede realizar para inducir una lesión unilateral, de modo que la corteza contralateral puede servir como un comparador interno. Este protocolo demuestra las características de un CCI suave a una porción de la corteza que abarca las regiones primarias somatosensoriales y motoras. Esta área cortical fue elegida por su implicación en comportamientos sensorimotores para los cuales numerosas pruebas de comportamiento pueden detectar déficits inducidos por lesiones7. También se pueden detectar mejoras de comportamiento debidas a intervenciones terapéuticas para la TBI.
Una característica distintiva de la TBI es la disfunción neuronal generalizada en la región lesionada. Las neuronas lesionadas sufren muerte celular, y la conectividad de la red neuronal se interrumpe8,9. TBI interrumpe el reclutamiento de células madre endógenas, lo que conduce a mayores déficits de comportamiento aguas abajo10,11. El trasplante de células madre neurales y células derivadas de células madre se ha explorado como una posibilidad de restaurar la función en el cerebro lesionado. Además del potencial para restaurar los circuitos neuronales dañados, las células trasplantadas ejercen efectos paracrinos que promueven la supervivencia neuronal y la recuperación funcional de TBI12. Una variedad de tipos de células han sido trasplantados preclínicamente para evaluar su potencial restaurador en modelos de trastornos neurológicos13,14,15. La reciente popularización de la tecnología de células madre pluripotentes inducida16 ha facilitado el desarrollo de numerosas líneas de células madre humanas para uso experimental. Las pruebas preclínicas con células derivadas de hiPSC son un primer paso importante para caracterizar la eficacia terapéutica potencial de una línea celular dada contra enfermedades humanas. Este laboratorio ha desarrollado protocolos para diferenciar los hiPSC a los fenotipos neuronales17 en la búsqueda de células trasplantables para ayudar a la recuperación de lesiones cerebrales traumáticas.
Los experimentos en este protocolo utilizan un CCI unilateral para inducir TBI a la corteza somatosensorial y motora izquierda de ratones adultos. Una lesión leve de CCI resulta en un déficit funcional sostenido en la pata delantera derecha que se utiliza para realizar un seguimiento de los efectos del injerto de células neuronales derivado según la alta PSC en la recuperación funcional. Las pruebas de sensorimotor Forepaw en este protocolo se adaptaron a partir de la metodología establecida por Bouet y sus colegas18 y demostrada previamente por Fleming y sus colegas19. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo para la realización de una lesión cerebral experimental, trasplante terapéutico de células hiPS y análisis conductual e histológico de las medidas de resultados experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mild CCI como sistema modelo para probar la terapia regenerativa experimental
El modelo CCI es una herramienta valiosa para investigar los mecanismos de disfunción tisular después de una lesión mecánica en la corteza. La adenabilidad de los parámetros de lesión es una característica atractiva de este modelo. Alterar la profundidad Z del impacto, la velocidad o el tiempo de permanencia puede aumentar o disminuir la gravedad de la lesión según lo deseado por el investigador10<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Centro de Neurociencia y Medicina Regenerativa (CNRM, número de subvención G170244014). Agradecemos la asistencia de Mahima Dewan y Clara Selbrede en estudios piloto de eliminación de adhesivos. Kryslaine Radomski realizó cirugías preliminares de lesión cerebral y trasplante de células. Amanda Fu y Laura Tucker del laboratorio central de USU CNRM Preclinical Studies proporcionaron valiosos consejos sobre cirugías de animales y pruebas de comportamiento, respectivamente.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
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