Summary
스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.
Abstract
여기에서 우리는 포유류 세포 및 네 마 테 ode 난 모에 있어서의 단백질의 수 모 화 및 그들의 하위 세포 국 소화를 연구 하는 신규 한 방법을 제시 하 고 있다. 이 방법은 변형 된 스모-포착 단백질 단편, kmUTAG, Ulp1 스모 프로 테아 제 로부터 유래 된, 스트레스 내성 신진 효 모 클 루 근 균을 활용 한다. 우리는 항 체를 사용 하지 않고 다양 한 모델 시스템에서 수 모 닐 화를 연구 하기 위한 목적으로 kmUTAG의 특성을 적용 했습니다. 스모의 연구에 대 한, KmUTAG 항 체 기반 접근 방식에 비해 몇 가지 이점이 있다. 이 스트레스에 강한 스모-포착 시 약은 재조합 적으로 생산 되며, 많은 종에서 자생 하는 스모이 소 양식을 인식 하 고, 시판 되는 항 체와는 달리 무료, 비 접합 스모에 대 한 친화도를 감소 보여줍니다. 여기에 표시 된 대표적인 결과는 포유류 조직 배양 세포 및 네 마 테 오드 모 난 모에 있어서의 스모 컨 쥬 게이트의 국 소화를 포함 한다.
Introduction
이 방법의 목적은 재조합 스모-포착 UTAG (ULp 도메인 태그) 단백질을 사용 하 여 스모 컨 쥬 게이 터 단백질의 연구 및 분석을 용이 하 게 하기 위한 것 이다. 아래에 설명 된 바와 같이, UTAG는 스모 변성 단백질을 정화, 검출 및 시각화 하기 위한 다른 시 약과 접근법을 대신 하 여 사용할 수 있습니다. 성장 조건에 따라 세포는 스모 또는 스모 사슬로 수정 된 수백 또는 수천 개의 단백질을 함유 할 수 있습니다 (검토를 위해 커 셔 외 20061 과 케르 셔 20162). 이것은 특정 스모 변성 단백질의 기능적 분석에 대 한 상당한 어려움을 나타내며, 특히 특정 수 모 닐 화 대상의 분 획만이 실제로3개 수정 되기 때문 이다. 전사 조절, 단백질 항상성, 세포 스트레스에 대 한 반응, 유사 분열 증 및 감수 분열 시 염색 질 리 모델링이 같은 필수적인 세포 과정에서의 역할에 더하여; 이제는 스모, 스모 변성 단백질, 스모 통로 성분이 암 및 퇴행 성 신경 장애 등의 병리학에 대 한 바이오 마커로 서 잠재력을가지고 있다는 것이 충분히 명백 해지고 있다4,5,6 ,7. 이는 다양 한 세포 및 샘플에서 스모 변성 단백질의 검출 및 기능적 분석을 위한 견고 하 고 안정적 이며 쉽게 사용할 수 있는 도구와 혁신적인 접근법의 필요성을 강조 합니다.
많은 시스템에서, 스모 특이 적 항 체는 스모 변성 단백질의 검출, 분리 및 기능적 분석을 위한 선택의 시 약 이다8,9. 그러나, 일부 상업적으로 입수 가능한 스모 특이 적 항 체는 비싸고, 수량 또는 가용성이 제한적 이며, 격렬 한 가변 친화도 및 교차 반응성을 나타내는 경향이 있으며, 일부 경우에는 재현성10이 결여 된다. 하나의 대안적 접근법은 형질 전환 된 세포 및 유기 체에서에 피토 프 태그 스모의 발현 이지만, 스모에 피토 프 태그를 연결 하는 것은 인위적으로 단백질 표적11에 대 한 그의 컨 쥬 게이 션을 낮출 수 있다. 추가적으로,에 피토 프는 형질 전환 되지 않은 세포 또는 조직이 평가 될 때 유용 하지 않다.
Ulp1는 스모 접합 단백질12를 모두 처리 하 고 모 전 구체를 공정 하 게 하는 s. 세레 비시 로부터 보존 된 스모 프로 테아 제 이다. 뜻밖 관찰에 기초한 UTAG 시 약을 개발 하 여 Ulp1's 스모 가공에 있어서의 촉매 시스테인 (C580S)의 돌연변이가 스모의 분열을 예방할 뿐만 아니라, 스모 접합 단백질을 높은 것으로 함정에도 조류 패12. 편의상이 카 르 복 시-말단 스모-트래핑 Ulp1 (C580S) 단편을 UTAG (UD 태그에 대 한 짧은) 라고 합니다. UTAG는 스모 변성 단백질의 분리 및 검출에 사용 되는 항 스모 항 체에 대 한 유용한 대안을 나타내는 재조합 범 스모 포획 단백질 이다. 특히 스모에는 하나 또는 여러 개의에 피토 프만이 아니라, 기본적으로 접힌, 공액 스모를 인식 하는 것이 중요 합니다. UTAG의 단백질 안정성과 스모 결합 강도를 모두 개선 하기 위해, 스트레스에 강한 효 모 근 종 균 (Km)에서 utag의 변형을 생성 했습니다. KmUTAG는 스모 컨 쥬 게이트를 나노 몰 친화도13으로 단단히 묶습니다. 또한, kmUTAG는 높은 온도 (42 ° c), 환 원제 (5mm carboxyethyl) 포스 핀 히드로 클로 라 이드 (변성 제), 산화 제 (0.6% 과산화 수소) 및 비 이온 성 세제에 내성이 있습니다. 이 응력 허용 오차는 가혹한 정화 조건 및 장기간의 인큐베이션 시간 동안에 유익 하 여 안정성과 스모 포착 활동을 보장 합니다. 그러나 놀랍게도 KmUTAG의 스모 포획 활동은 시스테인 변성 시 약, 이온 성 세제 및 완전히 변성 된 단백질 추출 물과 호환 되지 않습니다. KmUTAG의 현저한 친화도 및 특성은이 시 약이 여러 종의 수 모 화 단백질의 연구를 위한 표준 레 퍼 토리의 일부가 될 수 있음을 나타낸다.
여기에서 우리는 재조합 형광 mCherry-KmUTAG 융합 단백질 (kmUTAG fl)을 이용 하 여 포유류 세포 및 선 충에서 스모 변성 단백질을 검출 하는 간단한 방법을 제공 한다.
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Protocol
1. 재조합 KmUTAG-FL 스모를 사용 하 여 고정 조직 배양 세포에서 스모 검출 단백질을 포착
- 6 웰 TC 플레이트에서 선택의 조직 배양 세포를 22 mm 원형 커버에서 70% ~ 80%까지 성장 6 웰 플레이트에서 1.2 ~ 1.8 단계를 수행 합니다.
- DPBS (Dulbecco의 인산 완충 식 염 수가 1 mL)로 세포를 짧게 씻으십시오.
- 고정용으로, DPBS에 희석 한 4% 파라 포름알데히드 (PFA) 용액의 신선한 용액을 준비 하십시오. 세포를 고정 하려면 DPBS에 2 mL의 4% PFA를 각 웰에 추가 하십시오. 실 온에서 20 분 동안 세포를 배양 합니다. 참고: PFA를 사용 하는 모든 단계는 실험실 안전 후드에서 수행 해야 하며 PFA를 올바르게 배치 해야 합니다.
- 플레이트를 1 mL DPBS로 세척 하 고 5 분간 각 세척 하 여 고정 세포를 3 배 씻어 냅니다.
- 세포 투과를 위해 DPBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용 하 여 15 분 동안 배양 합니다.
- 플레이트를 변이 하는 동안 1 mL DPBS에서 3 배 셀을 세척 하 고, 5 분간 각 세척
- 10s 0.1의 500 µ l 글리신 (ph 2.0)을 사용 하 여 세포를 배양 한 다음, µ의 10 배 스모 프로 테아 제 버퍼 (SPB) 500로 즉시 pH를 중화 시킵니다.
- 1 mL DPBS에서 세포 세 배를 세척 하 고, 5 분간 각 세척
- 우물에서 커버 슬립을 제거 하 고 습도 챔버에 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립의 인큐베이터를 다음과 같이 진행 합니다.
- UTAG-fl 염색만을 위해: 튜브에 5mm TCEP를 포함 하는 100 µ L와 함께 1 µ g의 UTAG-fl을 혼합 한 후 커버 슬립의 셀에 혼합 한 후, 습도 챔버에서 1 시간 동안 실 온에서 배양 합니다.
- 선택적으로, UTAG-FL 및 안티 SUMO1 항 체 공동 염색을 위해, 다음을 진행:
- 튜브 1 µ g UTAG-FL 및 0.5 µ L SUMO2/38A2 (개발 연구를 위해 얻어진 하이브 리도 마 뱅크9)를 차단 완충 액의 100 µ l로 혼합 하 고, 커버 슬립 상에 서 혼합을 피 펫 하 고 1 시간 동안 상 온에서 배양 한다.
- 커버 슬립의 셀을 200 µ L DPBS로 3 회 세척 하 고 각각 5 분간 세척 합니다.
- 튜브 0.5 µ L 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 488 공액 항 체와 100 µ L 차단 완충 액을 혼합 하 고 커버 슬립 위에 혼합 한 후 실 온에서 1 시간 동안 배양 합니다.
- 커버 슬립을 세척 하기 위해, 피 펫 200 µ L DPBS를 각 커버 미 끄 러 짐에 넣고 10 분 동안 제자리에 둡니다. 2 회 이상 세탁을 반복 합니다.
- 마지막 세척에서 커버 슬립을 제거 하 고 장착 매체 한 방울로 사전 세척 된 현미경 슬라이드에 뒤집어 놓습니다 ( 재료 표참조).
- 현미경으로 보기 전에-20°c 냉동 고에 하룻밤 보관 하십시오. DAPI에 대 한 적절 한 필터 세트를 사용 하 여 시각화, 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 알 렉 사 Fluor 488 (옵션 SUMO2/3 공동 염색이 수행 되는 경우).
2. 우 태그-fl을 사용 하 여 수정 된 오 마 충 생식의 스모 탐지
- Μ를 폴 리 라이 신으로 코팅 된 더하기 충전 된 슬라이드에 8 개의 계란 버퍼 (14 )로 성인 암수를 양도 한다. 27.5 G 바늘을 사용 하 여 웜에서 생식 광고를 풀어. 항 체 라벨링 또는 UTAG-fl 라벨링 중 하나를 진행 합니다.
- 항 체 라벨링 샘플의 경우, 다음과 같이 진행 하십시오.
- 액체 질소에서 샘플을 동결 하 고 Coplin 항아리에-20°c 메탄올에서 밤새 고정 시킵니다.
- 또한 Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 3 회 슬라이드를 세척 한 다음 0.5% BSA와 0.1% 트윈 20을 포함 하는 PBS에서 20 분 동안 차단 합니다.
- 시 편을 덮고 있는 각 슬라이드에 30 µ L의 항 스모 6F2 항 체 (1:10)를 추가 한다. 4°c의 습도 챔버에서 밤새 배양 한다.
주의: 스모 6F2는 개발 연구에서 하이브 리도 마 은행 (15) 로부터 얻었다. - Coplin 항아리에, 1 개 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 세척 한 후 30 µ L의 DyLight 488 염소 안티 마우스 2 차 항 체 (1:200)를 사용 하 여 실 온의 습도 챔버에서 1.5 시간 동안 시료를 처리 합니다.
- Coplin 항아리에 1 개의 PBS에서 2 분 동안 슬라이드를 씻고 dH20에서 빠른 딥을 수행한 다음 장착 매체가 있는 슬라이드를 장착 합니다 ( 재질 표참조).
- KmUTAG-fl 라벨링의 경우 다음을 진행 하십시오.
- 셀을 고정 하려면 샘플에 1 부피의 8% PF를 추가 하 여 최종 농도가 4% PF가 되도록 하십시오. 습도 챔버에서 10 분 동안 수정 하 고 0.1 M 글리신을 가진 1x PBS를 포함 하는 Coplin 항아리에 슬라이드를 적어도 5 분 동안 전달 하 여 반응을 냉각 시킵니다.
- Coplin 항아리에서, 세포를 1x PBS에서 5 분 동안 세척 한 다음 샘플을 10 분 동안 0.1%의 트리톤-X를 포함 하는 1x PBS에 침투 시킵니다.
- Coplin 용기에 1x PBS에서 적어도 5 분 동안 세척 한 다음, 슬라이드의 샘플에 µ의 0.1 M 글리신 (ph=2.0)을 10 초간 200 추가 합니다. 즉시 200 µ L을 추가 하 여 pH를 무력화 합니다.
- Coplin 항아리에 1x PBS로 슬라이드를 5 분간 씻으십시오.
- 슬라이드의 선 충 선 2 µ g를 포함 하는 µ의 1x SPB + 5mm tcep의 세척 및 피 100 펫에서 미 끄 러 지는 것을 제거 하 고, 흔들림 없이 1 시간 동안 습도 챔버에서 배양 합니다.
- Coplin 항아리에 슬라이드를 반환 하 고 1x PBS에서 15 분 동안 세척
- 세척에서 슬라이드를 제거 하 고 실험실 와이프를 사용 하 여 샘플 주위를 말린 다음 5 µ의 장착 매체와 함께 슬라이드를 장착 하십시오 ( 재료 표참조). 슬라이드를 4°c에 보관 하십시오. DAPI (DNA), 텍사스 레드 (kmUTAG fl) 및 DyLight 488 (SUMO2에 대 한 적절 한 필터 집합을 사용 하 여 시각화 합니다.
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Representative Results
KmUTAG-fl은 재조합, mCherry 태그 스모 포획 단백질. KmUTAG-fl을 생산 하기 위해, 코 돈에 최적화 된 mCherry-kmUTAG를 pSPOT1 세균과 발현 플라스 미드에 클로닝 하였다 (도 1). 유도 후, kmUTAG-fl 단백질을 스팟 트랩에 정제 하 고, 용 출 하 고, 추후 사용 될 때까지 냉동 시켰다. KmUTAG fl의 스모 포획 활동을 보장 하기 위해, SUMO1 융합 단백질의 침전 및 강 우에 대 한 결합을 확인 했습니다 (데이터는 표시 되지 않았지만 이전 작업13참조).
고정 된 PNT2 세포로 배양 한 KmUTAG-fl-자이 스 Axioplan 현미경에 대 한 적절 한 필터 세트 (크로마) 및 100 배 유 액 침 목표를 사용 하 여 관찰 하였을 때 뚜렷한 핵 염색을 보였다 (그림 2-우측 패널). 확산 핵 염색과 뚜렷한 핵 초점을 모두 볼 것입니다. 핵 현지화는 DAPI와 공동 염색을 사용 하 여 확인 되었다 (그림 2-왼쪽 상단 패널). 쿠 무 태그-fl의 스모 포획 활동과 일치 하는 핵 국 소화 패턴은 SUMO2/3 염색을 연상 시켰다. 안티 SUMO2/3 8A2 항 체와의 공동 염색 (그림 2 -왼쪽 아래 패널)은 SUMO2 신호와 함께 kmUTAG fl의 공동 현지화를 확인 했습니다 (그림 2-병합, 오른쪽 아래). 이는 포유동물 세포에서 SUMO2를 검출 하기 위해 KmUTAG-fl의 효능을 검증 한다.
KmUTAG-fl은 범 스모의 특이성을 나타내므로, C에서 테스트 했습니다 . kmutag fl의 현지화 패턴이 이전에 보고 된 항-스모 항 체와 mcherry의 패턴과 일치 하는지 확인 하는 것이 좋습니다.: 스모 융합 단백질 8,15. 난 모 세포 생산 성인 양성에서 고립 된 생식 기는 반대로 스모 항 체 또는 kmUTAG-fl로 라벨링을 위해 처리 되었습니다. 이전 보고서와 일치 8, 항 스모 항 체는 처음에는 늦은 meiotic의 nucleoplasm에 국한 prophase 난 모 세포 (도 3a, C). 그런 다음 핵 봉투가 부 러 지는 것과 염색체 의회 (그림 3b, D)를 향하여 짝을 이룬 동족 체 (bivalents)의 중앙 링 콤플렉스 (RC)로 재분배 됩니다. DAPI 염색 동족 체 사이에 위치 하는 링 콤플렉스의 구성 요소에는 게이-17(e3 스모 리 제)와 스모 공액 발 색 키나 신 8이 모두 포함 된다. 병행 준비에서, 곤 광고는 KmUTAG-fl로 표시 된 유사한 패턴을 밝혔다 (그림 3e, F). KmUTAG-fl은 nucleoplasm에 라벨링 으로부터 이동 하 여 고리 복합체에 집중 하 고, 난 모 세포는 도 3e에-1의 난 모 세포를 시작 하 고 , 핵 봉투 붕괴 과정을 완료 하였다. 이 결과는 C. 엘 레 강 스와 아마도 다른 선 충에 있는 감수 분열 및 스모 관련 과정의 분석을 위한 유용한 도구로 kmutag fl의 유효성을 검사 합니다.
그림 1입니다. 이 방법에 사용 되는 kmUTAG-fl 스모 포획 융합 단백질의 도식 적 표현. 스팟 태그 벡터 pSPOT1는 KmUTAG fl의 표현식에 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 포유류 세포에서 SUMO2와 함께 kmUTAG-fl 공동 현지화. PNT2 세포는 커버 슬립에 성장 하 고, 고정 하 고, DAPI를 포함 하는 장착 매체를 적용 하기 전에 KmUTAG-fl 및 안티 SUMO2 8A2 항 체로 염색 하였다. 슬라이드는 DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG fl) 및 GFP (안티 SUMO2)에 대 한 공초점 현미경 및 적절 한 필터를 사용 하 여 가시화 되었다. kmUTAG-fl PNT2 셀의 SUMO2와 함께 현지화 되었습니다. 스케일 바 = 20 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 항 스모 항 체와 KmUTAG fl에의 한 스모 라벨링의 비교 . (A) 근 위 c. 엘 더 스 Gonad의 개략도. 모 세포를 개발 하는 것은 자 궁에 들어가기 전에 수정 되는 spermatheca (sprmth)에 게 하나씩 들어갑니다. -1 위치에 있는 난 모 세포는 즉시 spermatheca에 인접 하 여 풍부 하 게 하기 전에 핵 봉투 고장을 겪습니다. 풍부 하 게 함 후에, 정자 염색 질은 난 모 세포 염색체가 그들의 meiotic 사단을 완료할 때까지 응축 된 상태에 남아 있습니다. (B) 상 동성 염색체 후에 형성 되는 염색체이의 구조를 나타내는 개략도는, 그들의 synaptomenal 복합물을 분해 하 고, 비유에 대 한 준비에서 응축 시켰다. 동족 체 사이의 중앙 고리 복합체 (RC)는 오로라 키나 아 제 및 체크 포인트 단백질의 BUB-1 뿐만 아니라, E3 스모 리 나 제이-17 및 크로 니 신에도 풍부 하다. (C&D) 상기 난관 (C) 내에 난 모 세포를 개발 하 고, 항-스모 항 체를 사용 하 여 표지 된 감수 분열 I (D)의은 유 세포를 새로 수정 하는 라인. (C&D) 오른쪽에 있는 풀 사이즈 이미지는-2 및 1 핵의 결합 된 (m) 및 단일 채널 DAPI 및 항-스모 항 체 이미지를 보여주고, I 스핀 들 영역을 보여준다. o = 난 모 세포의 염색체, s = 정자 염색 질 질량. (E-F) 클로 표지 된 오비 덕트 내 난 모 세포의 개발-fl. 링 콤플렉스의 KmUTAG-fl의 농도는 핵 봉투 붕괴 직전에 시작 (- E에서 1 난 모 세포) 그리고 핵 봉투 후에 고리 복합물로 크게 제한 된다 분해 ( F-1의 난 모 세포). 파란색 = DAPI. 축척 막대 = 5 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 고정 포유류 세포에서 스모의 기능적 연구를 위한 재조합 단백질 인 kmutag-fl의 사용을 소개 하 고, 선 충 생식 기를 해 부 한다. KmUTAG-fl은 기본 스모 컨 쥬 게이 터 단백질과 스모 체인을 인식 하 고 트래핑 하는 스트레스를 견 디는 팬 스모 특정 시 약입니다. 스모의 3 차 구조는 고도로 보존 되어 있기 때문에 추가 모델과 비 모델 시스템에서 스모 변형이 kmUTAG-fl 시 약으로 분석 될 수 있는 가능성이 매우 높습니다. 이와 같이, KmUTAG-fl은 전통적인 항 체 염색 프로토콜을 위한 유용한 대안적인 또는 이차 시 약을 나타낼 수 있다.
탄수화물 검출을 위한 렉 틴 뿐만 아니라 단백질의 생체 내 라벨링을 위한이 머 티 드의 뉴클레오티드 및 아핀 펩타이드를 포함 한 비 항 체 대안의 사용에 대 한 충분 한 선례가 있다 16,17,18 ,19. 또한 스모를 결합 하 고 다른 단백질18,21에서 스모 상호 작용 하는 모티프 (심즈)와의 상호작용을 막는 것이 생성 되었습니다. 그러나, 우리의 지식에, KmUTAG-fl는 첫 번째 재조합 형광 범 스모-고정 세포에서 스모 접합 체의 직접 시각화를 위한 단백질을 포착. KmUTAG-fl은 스트레스에 강한 효 모, k. 마르시 누스 (Ulp1)에서 유래한 것으로, 이것은 놀라운 안정성 13을 설명할 수 있습니다. 대부분의 항 체와는 달리, KmUTAG는 가시화를 위한 이차 항 체가 필요 하지 않으며, 염색 된 세포는 형광 현미경 하에서 쉽게 가시화 된다. 포유류 세포에서의 스모 콘 쥬 게이트에 대 한 분석 및 선 충 생식 기는 kmutag 기반 이미징은 스모 항 체 염색에 호의적으로 비교 하 고 약간의 소음을 보여줍니다 (예: 그림 3a, B 와 그림 3d 비교). , E).
프로토콜의 중요 한 단계에는 신선한 파라 포름알데히드를 사용 하는 것과 스모를 유지 하기 위한 짧은 고정 시간이 포함 되어 있습니다. 또한, 낮은 pH 글리신 용액으로 고정 세포를 간단히 처리 하면 스모에 대 한 민감성이 증가 합니다. 그러나 모든 샘플이 KmUTAG-fl을 사용 하 여 분석에 자신을 빌려 줄 수는 없습니다. 항 체 기반 프로토콜과 마찬가지로, 새로운 세포 유형 또는 조직에서 스모를 현지화 하려고 할 때, 세제 선택 및 세제 농도는 중요 한 변수 일 수 있다. 궁극적으로, 우리는 살아있는 세포, 유기 체 및 조직 생 검의 스모 역학을 감지 하는 데 사용할 수 있는 세포 침투 kmUTAG 단백질을 포함 한 추가 KmUTAG-fl 변종을 생성할 계획입니다.
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Disclosures
재조합 kmUTAG 시 약은 Kerafast.com를 통해 연구 공동체에 제공 된다.
Acknowledgments
우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구소의 모든 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다, 원고의 중요 한 독서에 대 한 나탈리 응 우 옌, 시퀀싱 Lidia Epp. 이 작품은 연방 연구 상용화 기금 MF16-LS에 의해 확인에 의해 지원 되었다. W & M 학생 들에 대 한 연구 지원은 베일리-휴스턴 연구 기금에 의해 제공 되었으며 찰스 센터는 리와 CH에 대 한 펠로 우 십을 존중 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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