Summary
SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.
Abstract
Hier presenteren we een nieuwe methode om de sumoylation van eiwitten en hun sub-cellulaire lokalisatie in zoogdiercellen en nematoden oöcyten te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van een recombinant gemodificeerde SUMO-trappen eiwit fragment, kmUTAG, afgeleid van de Ulp1 SUMO protease van de stress-tolerante ontluikende gist Kluyveromyces marxianus. Wij hebben de eigenschappen van de kmUTAG voor het bestuderen van sumoylation in een verscheidenheid van modelsystemen zonder het gebruik van antilichamen aangepast. Voor de studie van SUMO, heeft KmUTAG verscheidene voordelen wanneer vergeleken bij antilichaam-gebaseerde benaderingen. Deze stress-tolerante SUMO-trapping reagens is recombinant geproduceerd, erkent native SUMO isovormen van vele soorten, en in tegenstelling tot commercieel beschikbare antilichamen het toont verminderde affiniteit voor vrije, ongeconjugeerde SUMO. Representatieve resultaten hier zijn de lokalisatie van SUMO geconjugeerde in zoogdier weefselkweek cellen en nematoden oöcyten.
Introduction
Het doel van deze methode is het vergemakkelijken van de studie en analyse van SUMO-geconjugeerde eiwitten met behulp van de recombinante SUMO-trapping UTAG (ULP domein tag) eiwit. Zoals hieronder beschreven, UTAG kan worden gebruikt in plaats van andere reagentia en benaderingen te zuiveren, op te sporen en te visualiseren SUMO-gemodificeerde eiwitten. Afhankelijk van de groeiomstandigheden, cellen kunnen bevatten honderden of duizenden eiwitten die zijn gewijzigd met SUMO of SUMO ketens (voor de herziening Zie Kerscher et al. 20061 en Kerscher 20162). Dit is een aanzienlijke moeilijkheid voor de functionele analyses van specifieke SUMO-gemodificeerde eiwitten, vooral omdat slechts een fractie van een bepaalde sumoylation doelstelling is eigenlijk gewijzigd3. Naast hun rol in essentiële cellulaire processen zoals transcriptie regelgeving, eiwit homeostase, de reactie op cellulaire spanning, en Chromatin het remodelleren tijdens mitose en meiose; het is nu voldoende duidelijk geworden dat Sumo, Sumo-gemodificeerde eiwitten, en Sumo pathway componenten hebben ook potentieel als biomarkers voor pathologieën zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen4,5,6 ,7. Dit onderstreept de noodzaak van robuuste, betrouwbare en gemakkelijk beschikbare instrumenten en innovatieve benaderingen voor de opsporing en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten in een verscheidenheid van cellen en monsters.
In veel systemen, Sumo-specifieke antilichamen zijn de reagentia van de keuze voor de detectie, isolatie en functionele analyses van Sumo-gemodificeerde eiwitten8,9. Echter, sommige commercieel verkrijgbare SUMO-specifieke antilichamen zijn duur, beperkt in hoeveelheid of beschikbaarheid, vatbaar voor vertonen wild variabele affiniteiten en cross-reactiviteit, en in sommige gevallen gebrek aan reproduceerbaarheid10. Een alternatieve benadering is de uitdrukking van epitope-Tagged SUMO in getransformeerde cellen en organismen, maar het koppelen van epitope Tags aan SUMO kan kunstmatig lager zijn vervoeging aan eiwitten doelstellingen11. Bovendien, Epitopes zijn niet nuttig wanneer niet-getransformeerde cellen of weefsels worden geëvalueerd.
Ulp1 is een behouden SUMO protease uit S. cerevisiae dat beide processen de Sumo voorloper en desumoylates Sumo-geconjugeerde eiwitten12. We ontwikkelden de UTAG reagens gebaseerd op de toevallige observatie dat een mutatie van de katalytische cysteïne (C580S) in Ulp1's SUMO verwerking ULP domain (UD) niet alleen voorkomt Sumo splitsing, maar ook vallen Sumo-geconjugeerde eiwitten met hoge avidity12. Voor de eenvoud, verwees we naar deze Carboxy-Terminal SUMO-trapping Ulp1 (C580S) fragment als UTAG (kort voor UD TAG). UTAG is een recombinant pan-SUMO het vangen proteïne die een nuttig alternatief voor anti-SUMO antilichamen vertegenwoordigt die voor de isolatie en de opsporing van SUMO-gewijzigde proteïnen worden gebruikt. Belangrijker, het erkent specifiek native-gevouwen, geconjugeerde SUMO en niet alleen een of meerdere epitopes op SUMO. Ter verbetering van zowel de eiwit stabiliteit en SUMO bindende kracht van UTAG, genereerden we een variant van UTAG uit de stress-tolerante gist Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG stevig bindt SUMO-geconjugeerden met nanomolar affiniteit13. Bovendien, kmUTAG is bestand tegen verhoogde temperaturen (42 °C), verminderende agenten (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride), denatureringsmiddelen (tot 2 M ureum), oxyderende agenten (0,6% waterstofperoxyde), en niet-ionische detergentia. Deze stress tolerantie is gunstig tijdens de harde zuivering en langdurige incubatietijden, zorgen voor de stabiliteit en SUMO-trapping activiteit. Niet verrassend, echter, KmUTAG SUMO-trapping activiteit is onverenigbaar met cysteïne-wijzigen reagentia, Ionische detergenten en volledig gedenatureerde eiwitextracten. De opmerkelijke affiniteit en eigenschappen van KmUTAG geven aan dat dit reagens onderdeel kan worden van het standaard repertoire voor de studie van sumoylated eiwitten in meerdere soorten.
Hier bieden we een eenvoudige methode om SUMO-gemodificeerde eiwitten te detecteren in zoogdiercellen en nematoden met behulp van een recombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion-eiwit (kmUTAG-FL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de opsporing van SUMO in de cellen van de vaste weefselcultuur gebruikend recombinant KmUTAG-FL SUMO-vangt proteïne
- Kweek weefselkweek cellen van keuze op 22 mm ronde deksel glijdt in 6-goed TC platen tot 70%-80% Confluent. Voer stap 1,2 – 1.8 uit in de 6-well plaat.
- Was de cellen kort met 1 mL DPBS (Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing)
- Voor fixatie, bereid een nieuwe oplossing van 4% Paraformaldehyde (oplossing) (verdund in DPBS). Om cellen vast te stellen, voegt u 2 mL 4%-DPBS toe aan elk goed. Incubeer de cellen voor 20 min bij kamertemperatuur. Opmerking: alle stappen met behulp van het gebruik van de werkplaats moeten worden uitgevoerd in een laboratorium veiligheids kap en het moet worden verwijderd.
- Was de vaste cellen 3x in 1 mL DPBS terwijl nutating de plaat, 5 min elke wasbeurt.
- Aan permeabilize cellen, incubeer voor 15 min met 0,1% Triton X-100 in DPBS
- Was de cellen 3x in 1 mL DPBS terwijl nutating de plaat, 5 min elke was
- Incubeer de cellen met 500 µ L van 0,1 M glycine-HCL (pH 2,0) voor 10 s, dan neutraliseren pH onmiddellijk met 500 µ L van 10x SUMO protease buffer (SPB).
- Was de cellen 3x in 1 mL DPBS, terwijl nutating plaat, 5 min elke wasbeurt
- Verwijder de-dekglaasjes uit de put en plaats ze in een luchtvochtigheid kamer. Ga dan verder met incubaties op de dekglaasje als volgt:
- Voor UTAG-FL kleuring alleen: Meng 1 µ g UTAG-FL met 100 µ L van 1x SPB met 5 mM TCEP in een buis, Pipet de mix op de cellen op de dekglaasje, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 uur in de luchtvochtigheid kamer.
- Naar keuze, voor UTAG-FL en anti SUMO1 antilichaam mede-bevlekt, ga met het volgende te werk:
- Meng in een tube 1 µ g UTAG-FL en 0,5 µ L SUMO2/3 8A2 (verkregen voor ontwikkelings studies hybridoma Bank9) met 100 µ l van blokkering buffer, Pipet de mix op de dekglaasje, en incubeer in kamertemperatuur voor 1 uur.
- Was de cellen op de dekglaasje 3 keer met 200 µ L DPBS, 5 min elke wasbeurt.
- Meng in een buis 0,5 µ L anti-muis Alexa Fluor 488 geconjugeerd antilichaam met 100 µ L blokkering buffer, Pipet de mix op de dekglaasje, en incubeer in kamertemperatuur voor 1 uur.
- Te wassen-dekglaasjes, pipet 200 µ L DPBS op elke dekglaasje en laat op zijn plaats voor 10 min. Herhaal de was nog 2 keer.
- Verwijder dekglaasje uit de laatste wasbeurt en omkeren op een vooraf gereinigde microscopie dia met een druppel montage medium (Zie de tabel van materialen).
- Store 's nachts in een-20 °C vriezer voor het bekijken onder de Microscoop. Visualiseer gebruikend de aangewezen filter reeksen voor DAPI (DNA), Texas rood (kmUTAG-FL), en Alexa Fluor 488 (als facultatieve SUMO2/3 het co-bevlekt wordt uitgevoerd).
2. SUMO detectie in vaste nematoden gonaden met UTAG-FL
- Transfer Adult hermafrodieten naar een 8 µ L druppel ei buffer14 op een plus-charged dia die is bekleed met poly-l-lysine. Release gonaden van de wormen met behulp van 27,5 G naalden. Ga verder met een antilichaam etikettering of UTAG-FL etikettering.
- Voor de etikettering van antilichamen gaat u als volgt te werk:
- Freeze-crack monsters in vloeibare stikstof en vervolgens vast 's nachts in-20 °C methanol in een Coplin pot.
- Ook in Coplin potten, dia's wassen voor 3 keer in 1x PBS, dan blok voor 20 min in PBS met 0,5% BSA en 0,1% Tween 20.
- Voeg 30 µ L van anti-SUMO 6F2 antilichaam (1:10) aan elke dia toe die de specimens behandelt. Incubeer overnachting in een vochtigheids kamer bij 4 °C.
Opmerking: SUMO 6F2 werd verkregen uit de ontwikkelings studies hybridoma Bank15. - In Coplin potten, was dia's voor 2 min in 1x PBS, dan dekking en incubeer specimens met 30 µ L van DyLight 488 geit-antimuis secundair antilichaam (1:200) voor 1,5 uren in een vochtigheids kamer bij kamertemperatuur.
- In Coplin potten, was dia's voor 2 min in 1x PBS, het uitvoeren van een snelle dip in dH20, en dan monteren de dia's met montage medium (Zie tabel van materialen).
- Voor KmUTAG-FL-etikettering gaat u als volgt te werk:
- Om cellen te bevestigen, voeg 1 volume van 8% PF aan steekproeven voor een definitieve concentratie van 4% PF toe. Bevestig voor 10 min in een luchtvochtigheid kamer en vervolgens de reactie doven door de overdracht van dia's naar een Coplin jar met 1x PBS met 0,1 M glycine voor ten minste 5 min.
- In Coplin potten, cellen wassen voor 5 min in 1x PBS, dan permeabilize de monsters in 1x PBS met 0,1% Triton-X voor 10 min.
- Was in een Coplin pot voor ten minste 5 minuten in 1x PBS, voeg dan 200 µ L van 0,1 M glycine-HCl (pH = 2,0) om de monsters op de dia gedurende 10 seconden. Voeg onmiddellijk 200 µ L van 10x SPB toe om pH te neutraliseren.
- Was de dia in 1x PBS in een Coplin pot voor 5 min.
- Verwijder dia van was en Pipet 100 µ L van 1x SPB + 5mM TCEP bevattend 2 µ g van UTAG-FL aan de nematoden op de dia's, en incubeer in vochtigheids kamer voor 1 h zonder het schommelen.
- Return de dia aan de Coplin kruik en was 15 min in 1x PBS
- Verwijder de dia uit het wassen, gebruik een laboratorium veeg om te drogen rond het monster, en monteer de dia's met 5 µ L van de montage medium (Zie de lijst van materialen). Sla de dia's op bij 4 °C. Visualiseer met behulp van de juiste filter sets voor DAPI (DNA), Texas Red (kmUTAG-FL), en DyLight 488 (SUMO2/3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KmUTAG-FL is een recombinant, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteïne. Om kmUTAG-FL te produceren, klonten wij een codon-geoptimaliseerde mCherry-kmUTAG in de pSPOT1 bacteriële overexpressie plasmide (Figuur 1). Na de inductie werd de kmUTAG-FL proteïne gezuiverd op Spot-TRAP, geëlueerd, en bevroren tot verder gebruik. Om de SUMO-vangstactiviteit van KmUTAG-FL te verzekeren, bevestigden wij het binden aan SUMO1-geconjugeerde parels en precipitatie van een SUMO-katten fusieproteïne (gegevens niet getoond, maar zie vorig werk13).
KmUTAG-FL bebroed met vaste PNT2 cellen toonde een duidelijke nucleaire vlekken wanneer waargenomen met behulp van de juiste filter set (chroma) en een 100x olie-onderdompeling doelstelling op een Epifluorescent Zeiss Axioplan Microscoop (Figuur 2-top rechter paneel). Zowel diffuse nucleaire vlekken en verschillende nucleaire Foci waren zichtbaar. Nucleaire lokalisatie werd bevestigd met behulp van co-kleuring met DAPI (Figuur 2-top linker paneel). In overeenstemming met de SUMO-trapping activiteit van kmUTAG-FL de nucleaire lokalisatie patroon deed denken aan SUMO2/3 kleuring. Co-kleuring met anti SUMO2/3 8A2 antilichaam (Figuur 2 -linksonder paneel) bevestigde de co-lokalisatie van kmUTAG-FL met de SUMO2/3 signaal (Figuur 2-samenvoegen, rechtsonder). Dit valideert de werkzaamheid van KmUTAG-FL op te sporen SUMO2/3 in zoogdiercellen.
Sinds kmUTAG-FL vertoont pan-SUMO specificiteit, we ook getest op C. van de nematoden om te bepalen of de lokalisatie patroon van kmUTAG-FL zou overeenkomen met de eerder gerapporteerde patronen van anti-Sumo-antilichamen en mCherry:: Sumo Fusion eiwitten 8,15. Geïsoleerde gonaden van eicel-producerend volwassen hermafrodieten werden verwerkt voor etikettering met of anti-SUMO antilichaam of kmUTAG-fl. in overeenstemming met eerdere rapporten 8, anti-Sumo antilichamen aanvankelijk gelokaliseerd aan de nucleoplasm van late Meiotische Prophase oöcyten (Figuur 3a, C). Vervolgens herverdeeld naar de centrale ring complex (RC) van de gepaarde homologs (bivalenten) als de nucleaire envelop afgebroken en de chromosomen Congres naar de metafase plaat (Figuur 3b, D). Componenten van de ring complex, die is gelegen tussen de DAPI-gebeitst homologs, omvatten zowel GEI-17 (een E3 SUMO ligase) en SUMO-geconjugeerde chromokinesin 8. In parallelle preparaten, gonaden gelabeld met KmUTAG-FL geopenbaard soortgelijke patronen (figuur 3e, F). KmUTAG-FL verschoven van het labelen van de nucleoplasm te concentreren op de ring complex, zoals oöcyten begon (-1 eicel in figuur 3e) en voltooide (-1 eicel in figuur 3F) het proces van nucleaire envelop verdeling. Deze resultaten valideren KmUTAG-FL als een nuttig instrument voor de analyse van de meiose en SUMO-gerelateerde processen in C. en eventueel andere nematoden.
Figuur 1. Schematische weergave van de kmUTAG-FL SUMO-trapping Fusion eiwit gebruikt in deze methode. De spot-tag vector pSPOT1 wordt gebruikt voor de expressie van KmUTAG-fl. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. kmUTAG-FL colokalisatie met SUMO2/3 in zoogdiercellen. PNT2 cellen werden geteeld op-dekglaasjes, vast, en gekleurd met zowel KmUTAG-FL en anti-SUMO2 8A2 antilichaam, voor het aanbrengen van montage media met DAPI. Dia's werden gevisualiseerd met behulp van een confocale Microscoop en de juiste filters voor DAPI (DNA), mCherry (kmUTAG-FL), en GFP (anti SUMO2/3). kmUTAG-FL gelokaliseerd met SUMO2/3 in PNT2 cellen. Schaalbalk = 20 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van de SUMO-labeling door anti-SUMO antilichamen en KmUTAG-FL tijdens C. eicelrijping. (A) schematische van de proximale C. Gonade. Het ontwikkelen van oöcyten Voer de Spermatheca (sprmth) een-voor-een waar ze worden bevrucht voordat het invoeren van de baarmoeder. Oöcyten in de-1 positie, direct grenzend aan de Spermatheca ondergaan nucleaire envelop verdeling voorafgaand aan de bevruchting. Na de bevruchting blijft het sperma Chromatin in een verkorte toestand totdat de eicel chromosomen hun Meiotische divisies voltooien. (B) Schematische weergave van de structuur van een chromosomale bivalente dat vormen na homologe chromosomen hebben opnieuw gecombineerd, gedemonteerd hun synaptomenal complex, en hebben gecondenseerd in voorbereiding voor metafase. Een centrale ring complex (RC) tussen de homologs is verrijkt niet alleen in Aurora kinase en de Checkpoint Protein BUB-1, maar ook de E3 SUMO ligase GEI-17 en chromokinesin. (C-D) Een lijn van de ontwikkeling van oöcyten binnen de eileider (C) en een nieuw bevruchte eicel in de metafase van de meiose I (D), GELABELD met anti-Sumo-antilichaam. (C-D) Full-sized beelden aan de rechterkant tonen de gefuseerde (m) en Single Channel DAPI (D) en anti-SUMO antilichaam (S AB) beelden van de-2 en-1 kernen en de meta Phase I spindle regio. o = metafase I chromosomen van eicel, s = sperma Chromatin massa. (E-F) Het ontwikkelen van oöcyten binnen de eileider gelabeld met KmUTAG-fl. concentratie van KmUTAG-FL bij de ring complex begint kort voor nucleaire envelop verdeling (-1 eicel in E) en wordt grotendeels beperkt tot de ring complex na nucleaire envelop verdeling (-1 eicel in F). Blauw = DAPI. Schaalbalk = 5 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier introduceren we het gebruik van kmUTAG-FL, een recombinant eiwit, voor functionele studies van SUMO in vaste zoogdiercellen en ontleed nematoden gonaden. KmUTAG-FL is een stress-tolerante pan-SUMO specifieke reagens dat herkent en vangt native SUMO-geconjugeerde eiwitten en SUMO ketens. Aangezien SUMO de tertiaire structuur is zeer behouden is het zeer waarschijnlijk dat SUMO varianten van extra model en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met de kmUTAG-FL reagens. Als dusdanig, kan KmUTAG-FL een nuttig alternatief of secundair reagens voor de traditionele protocollen van de antilichamen kleuring vertegenwoordigen.
Er is ruime precedent voor het gebruik van niet-antilichaam alternatieven, met inbegrip van lectines voor koolhydraten opsporing evenals aptamer nucleotiden en affimer peptides voor in vivo etikettering van proteïnen 16,17,18 ,19. Bovendien, affimers en monobodies zijn gegenereerd die binden Sumo en voorkomen dat de interactie met Sumo-interacterende motieven (Sims) op andere eiwitten18,20,21. Nochtans, aan onze kennis, is KmUTAG-FL het eerste recombinante fluorescente pan-SUMO-vangt proteïne voor de directe visualisatie van SUMO geconjugeerde in vaste cellen. KmUTAG-FL is afgeleid van Ulp1 van een stress-tolerante gist, K. marxianus, en dit kan verklaren zijn opmerkelijke stabiliteit 13. In tegenstelling tot de meeste antilichamen, vereist KmUTAG geen secundair antilichaam voor visualisatie, en de bevlekte cellen zijn gemakkelijk zichtbaar onder de fluorescentiemicroscoop. Zowel onze analyses van SUMO geconjugeerde in zoogdiercellen en nematoden gonaden suggereren dat KmUTAG-based Imaging gunstig vergelijkt met SUMO antilichaam-kleuring en toont weinig ruis (bijv. Vergelijk Figuur 3a, B versus figuur 3D , E).
De kritieke stappen in het protocol omvatten het gebruik van verse Paraformaldehyde en een korte fixatie tijd om SUMO natively-gevouwen te houden zodat kan het door kmUTAG worden erkend. Ook de korte behandeling van vaste cellen met de lage pH Glycine oplossing verhoogt de gevoeligheid voor SUMO. Echter, niet alle monsters kunnen lenen zich voor analyse met KmUTAG-fl. Zoals met op antilichaam-gebaseerde protocollen, wanneer het proberen om SUMO in nieuwe cel types of weefsels te lokaliseren, kunnen de detergent keus en de detergent concentraties belangrijke variabelen zijn. Uiteindelijk zijn we van plan om extra KmUTAG-FL varianten met inbegrip van een cel-penetrerende kmUTAG eiwit dat kan worden gebruikt om SUMO dynamiek te detecteren in levende cellen, organoids, en weefsel biopten te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Recombinant kmUTAG reagentia worden verstrekt aan de onderzoekgemeenschap via Kerafast.com.
Acknowledgments
We willen graag alle leden van het Kerscher Lab bedanken voor hun steun, Nathalie Nguyen voor de kritische lezing van het manuscript, en Lidia EPP voor sequencing. Dit werk is ondersteund door de Commonwealth Research commercialisatie Fonds MF16-034-LS op OK. Ondersteuning van het onderzoek voor W & M studenten werd verzorgd door de Bailey-Huston onderzoek Fonds, en Charles Center eert beurzen aan RY en CH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
- Hay, R. T.
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
