Summary

تحديد كثافة القناة الصفراوية في كبد الفأر

Published: April 30, 2019
doi:

Summary

نقدم طريقة بسيطة وحساسة إلى حد ما لتحديد كمية دقيقة من كثافة القناة الصفراوية في كبد الماوس. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد آثار المعدلات الوراثية والبيئية وفعالية العلاجات المحتملة في نماذج الماوس من الأمراض الصفراوية.

Abstract

يستخدم الماوس على نطاق واسع ككائن حي نموذجي لدراسة الأمراض الصفراوية. لتقييم تطور ووظيفة النظام الصفراوية، يتم استخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك كيمياء المصل، والتحليل النسيجي، وتلطيخ المناعة لعلامات محددة. على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن توفر معلومات هامة حول النظام الصفراوية، فإنها في كثير من الأحيان لا تقدم صورة كاملة من العيوب التنموية القناة الصفراوية (BD) في جميع أنحاء الكبد كله. ويرجع ذلك جزئيا إلى القدرة القوية لكبد الفأر على استنزاف الصفراء حتى في الحيوانات التي لديها ضعف كبير في التنمية الصفراوية. هنا نقدم طريقة بسيطة لحساب متوسط عدد BDs المرتبطة بكل الوريد المدخل (PV) في أقسام تغطي جميع فصوص الفئران متحولة / المعدلة وراثيا. في هذه الطريقة، يتم تركيب الكبد وتقسيمها بطريقة نمطية لتسهيل المقارنة بين مختلف الأنماط الجينية والظروف التجريبية. يتم تحديد BDs عن طريق الفحص المجهري الخفيف للخلايا الصفراوية الملطخة بالسيتوكيراتين، ثم يتم عدها وتقسيمها على العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية الموجودة في قسم الكبد. على سبيل المثال، نبين كيف يمكن لهذه الطريقة أن تميز بوضوح بين الفئران البرية ونموذج الماوس لمتلازمة ألاجيل. الطريقة المعروضة هنا لا يمكن أن تحل محل التقنيات التي تصور بنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية. ومع ذلك، فإنه يوفر وسيلة سهلة ومباشرة لتقييم كمي تطوير BD ودرجة تشكيل رد الفعل القنواتي في الفئران.

Introduction

الشجرة الصفراوية هي جزء حاسم من كبد الثدييات، مما يسمح بمرور الصفراء من خلايا الكبد إلى الأمعاء. تتشكل القنوات الصفراوية داخل الكبد (BDs) من قبل الخلايا الأقنية الصفراوية، والتي تميز عن الخلايا الكبدية ثنائية القدرة من خلال الشق وTGFβ إشارة1،2. المواصفات المناسبة والالتزام من الخلايا الصفراوية وتجميعها في BDs ناضجة حاسمة لتطوير شجرة الصفراوية داخل الكبد. كما ينمو الكبد أثناء النمو أو عند تجديد الجهاز، يحتاج النظام الصفراوية لتطوير على طول الكبد لضمان الصرف الصفراويالسليم. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الأمراض المتلازمية وغير المتلازمية تؤدي إلى ندرة الـ BDs intrahepatic3. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي عدد من أمراض الكبد الحادة والمزمنة إلى ما يسمى بردود الفعل القنواتية في الكبد، والتي تعرف بأنها وجود عدد كبير من الخلايا التي تعبر عن علامات الصفراوية ولكنها لا تنشأ بالضرورة من الخلايا الصفراوية أو الشكل براءة اختراعBDs 4. في اضطراب متعدد الأنظمة متلازمة ألاجيل (ALGS)، haploinsufficiency من ligand الشق jagged1 (JAG1) يؤدي إلى تشكيل BD الفقراء وركود صفراوي5،6. وقد أثبت مختبرنا مؤخرًا أن خط الماوس Jag1 heterozygousالذي تم إنشاؤه سابقًا هو نموذج حيواني لندرة BD في ALGS8. في هذا النموذج الماوس من ALGS، الخلايا الأقنية لا تزال موجودة. ومع ذلك، فإنها تفشل في الالتزام بالاندماج في ناضجة، وبراءات الاختراع BDs8. ولذلك، فإن تحليل الكبد في نموذج من ندرة BD يتطلب أكثر من وجود واضح أو غياب الخلايا الأقنية. من المهم تقييم درجة وجود الـ BDs الناضجة في الكبد بدقة.

في علم الأمراض التشريحية ، هناك طرق كمية مقبولة لتقييم ما إذا كان هناك ندرة BD9. على سبيل المثال، الدراسات على ALGS في المرضى البشر غالبا ما تحدد درجة BD إلى نسبة الوريد المدخل (PV) عن طريق تحليل ما لا يقل عن 10 أوعية المدخل لكل خزعة الكبد9،10. تحليل شكل والحضور العام أو عدم وجود BDs براءات الاختراع، جنبا إلى جنب مع كيمياء المصل، يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير BD في الفئران11،12،13. ومع ذلك، يمكن أن تفقد الفئران عددا كبيرا من BDs مع زيادة متواضعة فقط في مستوى البيليروبين المصل8. وبناء على ذلك، فإن الطريقة الكمية التي تقيّم عدد الـ BDs الموجودة لكل PV يمكن أن توفر مقياساً مباشراً أكثر لدرجة ندرة BD في الفئران. في تقرير صدر مؤخرا، قمنا بتحديد عدد BDs لكل PV عبر جميع فصوص الكبد وأبلغنا عن انخفاض كبير في نسبة BD إلى PV في Jag1 +/– الحيوانات8. خلال تحليلنا، لاحظنا أنه على الرغم من التباين الكبير في درجة الاستجابة الالتهابية وردود الفعل القنواتية، فإن نسبة BD إلى PV لا تظهر الكثير من التباين8. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي لنسبة BD إلى PV سمح لنا بإثبات أن إزالة نسخة واحدة من جين جليكوسيلترانسفيراز Poglut1 في Jag1+/– يمكن للالحيوانات أن تحسن بشكل كبير من ندرة BD8. في خلفية Jag1+/+ ، يؤدي فقدان Poglut1 المشروط في خلايا العضلات الملساء الوعائية إلى زيادة تدريجية في أعداد BD، وهو أمر متواضع (20-30٪) في P7 ولكن يصبح بارزا في البالغين8. مرة أخرى، سمحت لنا هذه التقنية لإظهار أنه حتى في P7، فإن الزيادة في كثافة BD في هذه الحيوانات كبيرة إحصائيا. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة كثافة BD في هذا النمط الجيني في أربعة أشهر من العمر تم التحقق من صحتها من خلال تحليل الراتنج المدلى بها أيضا. 8 هذه الملاحظات وغيرها من التقارير التي تقيس كثافة BD في مختلف نماذج الماوس ALGS14،15 دفعتنا إلى دمج هذه الطريقة في استراتيجيتنا الشاملة لتحليل العيوب الصفراوية في مختلف المتحولين والفئران المعدلة وراثيا.

هنا، ونحن بالتفصيل تقنية واضحة التي يمكن استخدامها لدراسة درجة ندرة BD في نماذج الماوس من أمراض الكبد (الشكل1). في هذه الطريقة، يتم استخدام التلطيخ المشترك مع علامات الخلايا الصفراوية سيتوكيراتين (CK) 8 و CK19 (فيما بعد CK واسعة الطيف، wsCK) لتصور BDs والخلايا الأقنية غير المدمجة في كبد الماوس. يتم إضافة جسم مضاد ضد أكتين العضلات ألفا الملساء (αSMA) إلى تلطيخ لعلامات السفن. التحليل المنهجي لنسبة BD إلى PV في قسم يغطي جميع فصوص الكبد يضمن تحليل عدد كبير من PVs لكل النمط الجيني. وبما أن أسلوبنا يعتمد على قياس الـ BDs وPVs في الصور ذات الأبعاد الـ 2، فإنه ليس مناسبًا لدراسة آثار طفرة معينة على البنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية أو سلامة القنوات الصفراوية الصغيرة. ومع ذلك، فإنه يوفر استراتيجية بسيطة وموضوعية للمحققين لتقييم التطور الصفراوية في الماوس.

Protocol

تم إيواء جميع الحيوانات في منشأة حيوانية حاجزة في كلية بايلور للطب وفقاً للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية وبموجب بروتوكولات الحيوانات المعتمدة. 1. مجموعة من أنسجة الكبد الماوس إعداد الماوس لحصاد الكبد قتل الفأر باستخدام الأ…

Representative Results

قمنا بتوثيق العيوب الصفراوية في Jag1+/- الحيوانات، نموذج الماوس من ALGS8. لتحديد نسبة BD إلى PV، قمنا بقسم كبد الماوس P30 وشاركفي تلوينها لCK8 و CK19 (wsCK) جنبا إلى جنب مع علامة الأوعية الدموية αSMA. ثم قمنا بتصوير جميع أجهزة الدفع الرباعي في كل فصوص من فصوص الكبد. كما هو …

Discussion

تحليل تطوير BD وإصلاح في الفئران هو أداة هامة في دراسة مسببات الأمراض وآلية الاضطرابات الصدغية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير علاجات جديدة يعتمد جزئيا ً على إنشاء نمط ظاهري قابل للاستنساخ ويفضل أن يكون قابلاً للقياس الكمي. النمط الظاهري الحالي في نماذج الماوس عادة ما ينطوي على كيمياء المصل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM084135 وR01 DK109982)، وجائزة تجريبية/جدوى من مركز تكساس الطبي لأمراض الجهاز الهضمي تحت معهد الصحة الوطنية P30 DK56338، وجائزة مسرّع متلازمة ألاجيل من المؤسسة الطبية.

Materials

Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22×50 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

References

  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Play Video

Cite This Article
Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

View Video