Summary

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

Published: April 30, 2019
doi:

Summary

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

Abstract

העכבר משמש באופן נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מחלות המרה. כדי להעריך את התפתחות ותפקוד של מערכת המרה, טכניקות שונות משמשות, כולל סרום כימיה, ניתוח היסטולוגית, וכתמים חיסוני עבור סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה יכול לספק מידע חשוב על מערכת המרה, הם לעתים קרובות לא מציגים תמונה מלאה של צינור המרה (BD) מומים התפתחותיים על פני הכבד כולו. זה חלק בשל היכולת האיתנה של כבד העכבר כדי לנקז את המרה אפילו בבעלי חיים עם ליקוי משמעותי בפיתוח המרה. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה כדי לחשב את המספר הממוצע של BDs המשויכים כל וריד הפורטל (PV) בסעיפים המכסים את כל האונות של עכברים מוטציה/טרנסגניים. בשיטה זו, כבדים מורכבים ומנות בצורה סטריאוטימית כדי להקל על השוואה בין גנוטיפים שונים ותנאים ניסיוניים. BDs מזוהים באמצעות מיקרוסקופ קל של מיקרוקרטין ויטראז ‘, ולאחר מכן נספר ומחולק על ידי המספר הכולל של PVs להציג באזור הכבד. לדוגמה, אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להבחין בבירור בין עכברים מסוג פראי לבין מודל עכבר של תסמונת אלאלאין. השיטה המוצגת כאן אינה יכולה להיות מחליפה לטכניקות המבראות את המבנה התלת-מימדי של עץ המרה. עם זאת, הוא מציע דרך קלה וישירה כדי לאמוד את פיתוח BD להעריך את מידת היווצרות התגובה ductular בעכברים.

Introduction

עץ המרה הוא חלק מכריע בכבד היונקים, ומאפשר למעבר המרה מהפטציטים לבטן. תעלות המרה בתוך הכבד (BDs) נוצרות על ידי המרה, אשר מבדילים בין הפוטנציאל הפוטנציאלי באמצעות חריץ וTGFβ איתות1,2. המפרט הנכון והמחויבות של המרה וההרכבה שלהם לתוך BDs בוגרת הם קריטיים לפיתוח עץ המרה הפנימי של הדלקת הכבד. כמו הכבד גדל במהלך הפיתוח או על התחדשות איברים, מערכת המרה צריך להתפתח לאורך הכבד כדי להבטיח ניקוז המרה תקין. יתר על כן, מספר מחלות syndromic ושאינם סינכדרומית התוצאה בפאולסיטי של BDs3. בנוסף, מספר מחלות הכבד חריפה וכרוניות להצמיח תגובות ductular כביכול בכבד, אשר מוגדרים כנוכחות של מספר משמעותי של תאים המבטאים סמנים המרה אך לא בהכרח נובעים תאי המרה או טופס פטנט BDs4. בתסמונת הפרעת המערכת הולטיסיסטים (algs), הפלוייתת של החריץ ליגjagged1 (JAG1) התוצאות במערך BD עני וכולאוסטזיס5,6. המעבדה שלנו הוכיחה לאחרונה כי שנוצר בעבר Jag1 heterozygous קו7 הוא מודל חיה של BD דלות ב algs8. במודל העכבר הזה של ALGS, האלאנגיוציטים עדיין נוכחים. עם זאת, הם נכשלים להתחייב להתאגדות לתוך בוגרת, פטנט BDs8. לכן, ניתוח של הכבד במודל של BD דלות דורש יותר מאשר נוכחות לכאורה או העדר המרה. חשוב להעריך במדויק את המידה שבה BDs בוגרים נמצאים בכבד.

בפתולוגיה אנאטומית, ישנן שיטות כמותיים מקובלות להערכת האם ה-BD דלות קיים9. לדוגמה, מחקרים על algs בחולים אנושיים לעתים קרובות לכמת את BD כדי וריד הפורטל (PV) יחס על ידי ניתוח לפחות 10 כלי הפורטל לכל כבד ביופסיה9,10. ניתוח של הצורה ואת הנוכחות הכללית או העדר פטנטים BDs, בשילוב עם כימיה סרום, יכול לספק מידע רב ערך על התפתחות BD בעכברים11,12,13. עם זאת, עכברים יכולים לאבד מספר משמעותי של BDs עם עלייה צנועה רק סרום בילירובין רמה8. לפיכך, שיטה כמותית המוערכת את מספר BDs הנוכחי לכל PV יכול לספק מידה ישירה יותר של המידה של BD דלות בעכברים. בדו ח האחרונות, אנו ככמת את מספר BDs לכל PV בכל האונות בכבד ודיווח ירידה משמעותית ביחס BD ל-PV ב Jag1 +/– בעלי חיים8. במהלך הניתוח שלנו, הבחנו כי למרות וריאציה משמעותית בדרגת תגובה דלקתית ותגובות ductular, BD ליחס PV לא להראות ההבדלים הרבה8. יתר על כן, הקוונפיקציה של BD ליחס PV מותר לנו להדגים כי הסרת עותק אחד של הגליסישיאז גן Poglut1 ב Jag1 +/– בעלי חיים יכולים לשפר באופן משמעותי את שלהם BD דלות8. ברקע Jag1 +/+ , אובדן מותנה של Poglut1 בתאי שריר וסקולריים החלקה תוצאות עלייה מתקדמת במספרי BD, אשר צנוע (20-30%) ב-P7 אבל הופך להיות בולט במבוגרים8. שוב, טכניקה זו אפשרה לנו להראות כי אפילו ב P7, הגידול בצפיפות BD בבעלי חיים אלה הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. של הערה, את צפיפות ה-BD מוגברת ב-גנוטיפ זה בגיל ארבעה חודשים היה מאומת באמצעות ניתוח שחקנים שרף גם. 8 תצפיות אלה ודוחות אחרים שנמדדו צפיפות BD במודלים algs עכבר שונים14,15 בקשה לנו לשלב את השיטה הזו לתוך האסטרטגיה הכוללת שלנו לנתח פגמים במרה במוטציות שונות ועכברים טרנסגניים.

כאן, אנו פירוט טכניקה פשוטה אשר ניתן להשתמש בה כדי לבחון את מידת ה-BD דלות בדגמי העכבר של מחלת הכבד (איור 1). בשיטה זו, שיתוף בשילוב עם סמנים הכולאנציט (CK) 8 ו CK19 (להלן הספקטרום הרחב CK, wsCK) משמש כדי להמחיש BDs ו המרה משולבת בכבד העכבר. נוגדן נגד אקטין שריר החלקה אלפא (αSMA) מתווסף לצביעת כלי התוויות. ניתוח שיטתי של BD ל-PV יחס בסעיף המכסה את כל האונות בכבד מבטיח כי מספר גדול של PVs מנותח עבור כל גנוטיפ. מאז השיטה שלנו מסתמך על ככמת BDs ו PVs ב-2D תמונות, זה לא מתאים ללמוד את ההשפעות של מוטציה נתונה על המבנה התלת-ממדי של עץ המרה או שלמות של תעלות המרה הקטן. עם זאת, הוא מספק אסטרטגיה פשוטה ואובייקטיבית עבור חוקרים להעריך את פיתוח המרה בעכבר.

Protocol

כל בעלי החיים שוכנו במתקן לבעלי חיים של המכשול בביילור קולג ‘ לרפואה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והנחיות וועדות שימוש בפרוטוקולים בעלי חיים מאושרים. 1. אוסף של רקמת הכבד של העכבר הכנת העכבר לקציר הכבד המתת החסד של העכבר באמצעות isofלוריאן. לבצע נקע בצו?…

Representative Results

בעבר תועדו פגמים המרה ב Jag1 +/– בעלי חיים, מודל העכבר של algs8. כדי לקבוע את היחס BD ל-PV, שP30 מנות כבדי העכבר ומוכתמות במשותף עבור CK8 ו CK19 (wsCK) יחד עם סמן כלי הדם αSMA. לאחר מכן אנו מ, לאחר מכן את כל PVs כל האונות בכבד. כפי שמוצג באיור 2A, הגדרתי pvs כמו כלי ?…

Discussion

ניתוח של פיתוח BD ותיקון בעכברים הוא כלי חשוב בלימוד פתוגנזה ומנגנון של הפרעות כיס הולסטטי. בנוסף, התפתחות הטיפולים החדשים תלויה בקביעת הפנוטיפים ובהתאם לתהליך המדידה. פנוטיפ הנוכחי במודלים העכבר כרוך בדרך כלל סרום כימיה, היסטולוגיה בכבד וכתמים חיסוני עבור מסוג תא סמנים ספציפיים. למרות טכ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01 GM084135 ו R01 DK109982), פרס פיילוט/היתכנות ממרכז הרפואי של טקסס מרכז מחלת העיכול תחת NIH P30 DK56338, ופרס מאיץ של תסמונת אלג’אין . הקרן הרפואית

Materials

Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22×50 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

References

  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Play Video

Cite This Article
Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

View Video