Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta
Summary
A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.
Abstract
A glândula lacrimal (LG) é uma glândula tubuloacinar exócrina que secreta uma camada aquosa de filme lacrimogêneo. A árvore epitelial da LG é composta de células acinares, Ductais epiteliais e mioepiteliais (MECs). MECS expressam o actina do músculo liso alfa (αsma) e têm uma função contrátil. Eles são encontrados em múltiplos órgãos glandulares e são de origem ectodérmica. Além disso, o LG contém células do músculo liso vascular SMA + de origem endodérmica chamada pericytes: células contrátil que envolvem a superfície dos tubos vasculares. Um novo protocolo nos permite isolar ambos os MECS e pericitos de LGS murino adulto e glândulas submandibulares (SMGS). O protocolo baseia-se na rotulagem genética de MECS e pericitos usando a cepa smaCreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/FL mouse, seguida da preparação da suspensão de célula única LG para triagem de células ativadas por fluorescência (FACS ). O protocolo permite a separação destas duas populações da pilha de origens diferentes baseadas na expressão da molécula epithelial da adesão da pilha (epcam) por MECS, visto que os pericitos não expressam epcam. Células isoladas podem ser usadas para o cultivo de células ou análise de expressão gênica.
Introduction
As células mioepiteliais (MECs) estão presentes em muitas glândulas exócrinas, incluindo lacrimal, salivar, harderiana, suor, próstata e mamária. Os MECs são um tipo de célula único que combina um fenótipo epitelial e um músculo liso. MECS Express α-músculo liso actina (SMA) e tem uma função contrátil1,2. Além dos MECs, a glândula lacrimal (LG) e a glândula submandibular (SMG) contém células vasculares de SMA + denominadas pericytes, que são células de origem endodérmica que envolvem a superfície dos tubos vasculares3. Embora MECS e pericitos expressem muitos marcadores, SMA é o único marcador que não é expresso em outras células LG e SMG1,3.
Nos últimos 40 anos, vários laboratórios relataram ensaios para dissociação de diferentes tecidos da glândula exócrina, nos quais foram aplicadas abordagens não enzimáticas e enzimáticas. Em um dos primeiros relatórios publicados em 1980, Fritz e coautores descreveram um protocolo para isolar o ácinos felino do parotid usando a digestão seqüencial em uma solução do Collagenase/Trypsin4. Em 1989, Hann e os coautores ajustaram este protocolo para o isolamento do ácinos dos LGS do rato usando uma mistura do Collagenase, do hialuronidase e do DNase5. Em 1990, Cripps e colegas publicaram o método de dissociação não enzimática da glândula lacrimal ácinos6. Mais tarde, em 1998, zoukhri e coautores retornaram a um protocolo de dissociação enzimática para acompanhamento de CA2 +-imagem em LG e SMG isolado ácinos7. Na última década, os pesquisadores voltaram seu foco no isolamento de células-tronco/progenitoras de glândulas exócrinas. Pringle e coautores descreveram um protocolo em 2011 para isolamento de células-tronco SMG do mouse8. Este método foi baseado no isolamento de salispheres contendo células-tronco, que foram mantidos em cultura. Os autores reivindicaram que as pilhas proliferating que expressam marcadores pilha-associados da haste poderiam ser isoladas destes salispheres8. Shatos e coautores publicaram o protocolo para o isolamento de células progenitoras de LGs de ratos adultos não lesionados usando digestão enzimática e coletando células “liberadas”9. Mais tarde, em 2015, Ackermann e os coautores ajustaram este procedimento para isolar as “pilhas de haste murine da glândula lacrimal presuntivo” (“mlgscs”) que poderiam ser propagadas como uma cultura da mono-camada sobre passagens múltiplas10. No entanto, nenhum dos procedimentos antes mencionados permitiu distinguir subtipos celulares e populações individuais de células epiteliais isoladas. Em 2016, gromova e coautores publicaram um procedimento para a isolação de pilhas da haste/progenitor de LG dos LGS murino adultos usando FACS11. Entretanto, este protocolo não foi pretendido isolar MECs.
Recentemente, temos demonstrado que somos capazes de isolar as células SMA + de 3 semanas de idade SMA-GFP camundongos12. Entretanto, neste tempo nós não separamos populações diferentes de pilhas de SMA +. Aqui nós estabelecemos um procedimento novo para o isolamento direto de MECS e de pericitos diferenciados dos LGS e dos SMGs adultos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito descreveu um protocolo de isolamento MEC e pericyte da LG e SMG. Este procedimento foi baseado na rotulagem genética de SMA, o único biomarcador de confiança de MECs e pericytes.
A urgência de desenvolver este protocolo foi motivada pela ausência quase total de literatura destacando o isolamento de MECs de LGs murino e SMGs. Embora a rotulagem genética fosse usada previamente, usando ratos de SMA-GFP para isolar pilhas de SMA + dos jovens três-week-old LGs<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Ivo kalajzic por nos fornecer a estirpe smaCreErt2 mouse, Takeshi umazume para rejeito mouse e genotipagem, Mark Shelley para adquirir fotos profissionais para a Figura 2. Agradecemos também ao Conselho de editores científicos da Scripps e Mark Shelley pela edição de inglês científico. Estamos gratos ao núcleo de citometria de fluxo do Scripps Research Institute para assistência com triagem celular e ao Dr. Robin Willenbring para múltiplas discussões/conselhos sobre a análise de dados FACS.
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde, National Eye Institute concede 5 R01 EY026202 e 1 R01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
