El aislamiento de las células mioepiteliales de la murina lagrimal adulta y las glándulas submandibulares
Summary
La glándula lagrimal (LG) tiene dos tipos de células que expresan α-actina muscular lisa (αSMA): células mioepiteliales (MECs) y pericytes. Los MECs son de origen ectodérmico, se encuentran en muchos tejidos glandulares, mientras que los pericitos son células musculares lisas vasculares de origen endodérmico. Este protocolo aísla los MECs y los pericitos de los LGS murinos.
Abstract
La glándula lagrimal (LG) es una glándula tubuloacinar exocrina que segrega una capa acuosa de película lagrimal. El árbol epitelial de LG se compone de acinar, epitelio ductal, y las células mioepiteliales (MECs). MECs expresan la actina del músculo liso alfa (αSMA) y tienen una función contráctil. Se encuentran en múltiples órganos glandulares y son de origen ectodérmico. Además, el LG contiene células de músculo liso vascular SMA + de origen endodérmico llamado pericytes: células contráctiles que envuelven la superficie de los tubos vasculares. Un nuevo protocolo nos permite aislar tanto los MECs como los pericitos de los LGS adultos y de las glándulas submandibulares (SMG). El protocolo se basa en el etiquetado genético de los MECs y pericitos utilizando la cepa SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse, seguida de la preparación de la suspensión de célula única LG para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS ). El protocolo permite la separación de estas dos poblaciones celulares de diferentes orígenes basadas en la expresión de la molécula de adhesión de células epiteliales (epcam) por los MECs, mientras que los pericitos no expresan epcam. Las células aisladas podrían utilizarse para el cultivo celular o el análisis de expresión génica.
Introduction
Las células mioepiteliales (MECs) están presentes en muchas glándulas exocrinas, incluyendo lagrimales, salivales, arderias, sudor, próstata y mamaria. Los MECs son un tipo de célula único que combina un epitelial y un fenotipo muscular liso. MECs Express α-actina del músculo liso (SMA) y tienen una función contráctil1,2. Además de los MECs, la glándula lagrimal (LG) y la glándula submandibular (SMG) contienen células vasculares SMA + denominadas pericytes, que son células de origen endodérmico que envuelven la superficie de los tubos vasculares3. Aunque los MECs y pericitos expresan muchos marcadores, SMA es el único marcador que no se expresa en otras células LG y SMG1,3.
En los últimos 40 años, varios laboratorios notificaron ensayos para la disociación de diferentes tejidos de la glándula exocrina, en los que se aplicaron enfoques no enzimáticos y enzimáticos. En uno de los primeros informes publicados en 1980, Fritz y coautores describieron un protocolo para aislar la parótida acinos felina utilizando la digestión secuencial en una solución de colagenasa/tripsina4. En 1989, Hann y coautores ajustaron este protocolo para el aislamiento acinos de los LGS de rata utilizando una mezcla de colagenasa, hialuronidasa y DNase5. En 1990, Cripps y colegas publicaron el método de disociación no enzimática de la glándula lagrimal acinos6. Más tarde, en 1998, zoukhri y coautores regresaron a un protocolo de disociación enzimática para el seguimiento de CA2 +-imágenes en LG y SMG aislado acinos7. En la última década, los investigadores han centrado su atención en el aislamiento de las células madre/progenitoras de las glándulas exocrina. Pringle y coautores describieron un protocolo en 2011 para el aislamiento de las células madre SMG del ratón8. Este método se basó en el aislamiento de las saliesferas que contenían células madre, que se mantuvieron en la cultura. Los autores afirmaron que las células proliferantes que expresaban marcadores asociados a células madre podían aislarse de estas saliesferas8. Shatos y coautores publicaron el protocolo para el aislamiento de células progenitoras de LGs de rata adulta no lesionada usando digestión enzimática y recogiendo células “liberadas”9. Más tarde, en 2015, Ackermann y coautores ajustaron este procedimiento para aislar presuntivas “células madre de la glándula lagrimal murina” (“mLGSCs”) que podrían propagarse como una cultura Mono-capa a través de múltiples pasajes10. Sin embargo, ninguno de los procedimientos antes mencionados permitió distinguir subtipos celulares y poblaciones individuales de células epiteliales aisladas. En 2016, Gromova y coautores publicaron un procedimiento para el aislamiento de las células madre/progenitoras de LG de los LGs adultos de murina utilizando FACS11. Sin embargo, este Protocolo no pretendía aislar los MECs.
Recientemente, hemos demostrado que somos capaces de aislar las células SMA + de 3 ratones SMA-GFP de una semana de edad12. Sin embargo, en este momento no hemos separado diferentes poblaciones de células SMA +. Aquí establecimos un nuevo procedimiento para el aislamiento directo de MECs diferenciados y pericitos de LGS y SMG adultos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describió un protocolo de MEC y aislamiento de pericytes de LG y SMG. Este procedimiento se basó en el etiquetado genético de SMA, el único biomarcador confiable de MECs y pericytes.
La urgencia de desarrollar este protocolo estaba motivada por la ausencia casi total de literatura que destacaba el aislamiento de los MECs de los LGs murinos y los SMG. Aunque el etiquetado genético fue utilizado previamente, utilizando ratones SMA-GFP para aislar las células SMA + de jóven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Ivo Kalajzic por proporcionarnos la cepa SMACreErt2 mouse, Takeshi umazume para el ratón de cola y genotipado, Mark Shelley para la adquisición de imágenes profesionales para la figura 2. También agradecemos al Consejo de editores científicos de Scripps y a Mark Shelley por la edición de inglés científico. Estamos agradecidos con el núcleo de citometría de flujo de Scripps Research Institute para la asistencia con la clasificación celular y para el Dr. Robin Willenbring para múltiples discusiones/consejos sobre el análisis de datos de FACS.
Este trabajo fue apoyado por los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de ojos otorga 5 r01 EY026202 y 1 r01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
