성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립
Summary
눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.
Abstract
눈물 샘 (LG)은 인 열 막의 수성 층을 은닉 하는 외 각 성 tubuloacinar 동맥입니다. LG 상피 나무는 포상, ductal 상피 및 근 상피 세포 (MECs)로 구성 됩니다. MECs 익스프레스 알파 평활 근 액 틴 (α Sma)와 수축 기능을가지고 있습니다. 그들은 여러 선상 기관에서 발견 되 고 외 배 엽 기원입니다. 또한, LG에는 혈관 관의 표면을 감싸는 수축 세포 인 내 진 피 기원의 SMA + 혈관 평활 근 세포가 포함 되어 있습니다. 새로운 프로토콜을 통해 우리는 성인 뮤 린 LGs 및 턱 밑 샘 (SMGs)에서 MECs와 심 낭을 모두 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl 마우스 스트레인을 사용 하 여 mecs 및 심 낭의 유전 적 라벨링을 기반으로 하며, 형광 활성 세포 선별을 위한 LG 단일 세포 현 탁 액의 준비를 따른다 (FACS ). 이 프로토콜은 흉 막이 EpCAM을 표현 하지 않는 반면에, MECs에의 한 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)의 발현에 기초한 상이한 기원의 이들 두 세포 집단의 분리를 허용 한다. 고립 된 세포는 세포 배양 또는 유전자 발현 분석에 사용 될 수 있었다.
Introduction
근 상피 세포 (MECs)는 눈물, 타 액, harderian, 땀, 전립선 및 유선을 포함 한 많은 외 분 비 동맥에 존재 합니다. MECs는 상피와 평활 근 표현 형을 결합 하는 독특한 세포 유형입니다. Mecs 익스프레스 α-평활 근 액 틴 (SMA) 및 수축 기능1,2를 갖는다. MECs 외에도 눈물 동맥 (LG)과 턱 밑 동맥 (기관단총)은 혈관 관의 표면을 감싸는 내 진 피 기원의 세포 인 심 낭 이라는 SMA + 혈관 세포를 포함 합니다. Mecs와 심 낭은 많은 마커를 표현 하지만, SMA는 다른 LG 및 기관단총 세포1,3에서 표현 되지 않는 유일한 마커 이다.
지난 40 년 이내에, 몇몇 실험실은 다른 외 분 비 동맥 조직의 해리에 대 한 분석을 보고,이는 비효소 및 효소 적 접근법을 적용 하였다. 1980에 발표 된 첫 번째 보고서 중 하나에서, 프리츠와 코 저자는 콜라 게 나아 제/트립 신 솔루션4에서 순차 소화를 사용 하 여 고양이를 분리 하는 프로토콜을 설명 했다. 1989에서, hann 및 공동 저자는 콜라 게 나 제, 히 알루로 니다 제 및 dnase5의 혼합물을 사용 하 여 LGs에서의 느리게만 격리를 위해이 프로토콜을 조정 하였다. 1990에서, cripps 및 동료는 눈물 샘의 느리게만6의 비 효소 적 해리의 방법을 간행 했습니다. 나중에 1998에서 주크 리와 공동 저자는 LG 및 서울시 고립 된 느리게만7에서의 Ca2 +이미징에 대 한 효소 해리 프로토콜을 반환 했습니다. 지난 10 년 내에 연구원 들은 외 분 비 땀 샘의 줄기/전구 세포의 분리에 초점을 돌렸다. Pringle 및 공동 저자는 마우스 기관단총 줄기 세포의 분리를 위한 2011의 프로토콜을 설명 했다8. 이 방법은 배양에서 유지 되었던 줄기 세포 함유 돌출 구의 분리를 기초로 하였다. 저자는 줄기 세포 관련 마커를 발현 하는 세포 증식이 살 리 구체8에서 분리 될 수 있다고 주장 했다. 샤 로스와 공동 저자는 손상 되지 않은 성인 쥐 LGs에서 효소 소화를 사용 하 고 “해방 된” 세포9를 수집 하는 전구 세포 분리에 대 한 프로토콜을 발표 했습니다. 나중에, 2015에서, Ackermann과 공동 저자는 추정 “뮤 린 눈물 동맥 줄기 세포” (“mLGSCs”)를 여러 통로에 걸쳐 모노 층 문화로 전파할 수 있는 분리 하기 위해이 절차를 조정 했습니다. 그러나, 이전에 언급 한 절차의 아무도 분리 된 상피 세포의 세포질 특수형과 개별 인구를 구별 하기 위하여 허용 했습니다. 2016에서 그로 모 바와 코 저자는 FACS11을 사용 하 여 성인 뮤 린 LGS에서 LG 줄기/전구 세포를 분리 하는 절차를 발표 했습니다. 그러나이 프로토콜은 MECs를 격리 하기 위한 것이 아닙니다.
최근에, 우리는 3 주 된 SMA GFP 쥐12에서 sma + 세포를 분리할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나,이 시간에 우리는 SMA + 세포의 다른 인구를 분리 하지 않았습니다. 여기에서 우리는 성인 LGs와 SMGs에서 차별화 된 MECs와 심 낭을 직접 분리 하기 위한 새로운 절차를 수립 했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 LG와 기관단총의 MEC 및 심 낭 분리의 프로토콜을 설명 했습니다. 이 절차는 SMA의 유전 라벨링, MECs 및 심 낭의 유일한 신뢰할 수 있는 바이오 마커를 기반으로 했습니다.
이 프로토콜을 개발 하는 긴급 한 뮤 린 LGs 및 SMGs에서 MECs의 고립을 강조 하는 문학의 거의 총 부재에 의해 동기 부여 했다. 유전 라벨링을 이전에 사용 했지만, SMA-GFP 쥐를 사용 하 여 젊은 3 주 된 LGs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 SMACreErt2 마우스 스트레인을 우리에 게 제공 하는 Dr. Ivo kalajzic 감사 합니다, 마우스 꼬리와 유전형에 대 한 마 누 즈 메,도 2에 대 한 전문적인 사진을 얻기 위한 마크 셸리. 우리는 또한 과학적인 영어 편집을 위한 과학 편집자와 마크 셸리의 스 크립 스 위원회 감사 합니다. 우리는 셀 선별 및 FACS 데이터 분석에 대 한 여러 토론/조언에 대 한 닥터 로빈 윌 렌에 도움을 위한 스 크립 스 연구 기관 유 세포 분석 코어에 감사 드립니다.
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다, 국가 안과 연구소 보조금 5 R01 EY026202 및 1 R01 EY028983 H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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