Isolering av Myoepithelial celler fra voksen murine Lacrimal og submandibular kjertler
Summary
Den lacrimal kjertel (LG) har to celletyper uttrykker α-glatte muskel utgangen (αSMA): myoepithelial celler (MECs) og pericytes. MECs er av ectodermal opprinnelse, finnes i mange kjertel vev, mens pericytes er vaskulær glatte muskelceller av endodermal opprinnelse. Denne protokollen isolerer MECs og pericytes fra murine LGs.
Abstract
Den lacrimal kjertel (LG) er en eksokrin tubuloacinar kjertel som utskiller en vandig lag av tåre film. The LG epitel treet består av acinar, ductal epitel, og myoepithelial celler (MECs). MECs uttrykke Alpha glatt muskel utgangen (αSMA) og har en kontraktile funksjon. De finnes i flere kjertel organer og er av ectodermal opprinnelse. I tillegg inneholder LG SMA + vaskulære glatte muskelceller av endodermal opprinnelse kalt pericytes: kontraktile celler som innhylle overflaten av vaskulære rør. En ny protokoll tillater oss å isolere både MECs og pericytes fra voksen murine LGs og submandibular kjertler (SMGs). Protokollen er basert på genetisk merking av MECs og pericytes bruker smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse belastning, etterfulgt av utarbeidelse av LG enkelt celle suspensjon for fluorescens aktivert celle sortering (FACS ). Protokollen gjør det mulig for separasjon av disse to celle populasjoner av ulik opprinnelse basert på uttrykket av epitel cellen vedheft molekyl (EpCAM) av MECs, mens pericytes ikke uttrykke EpCAM. Isolerte celler kan brukes til celle dyrking eller gen uttrykks analyse.
Introduction
Myoepithelial celler (MECs) er til stede i mange eksokrin kjertler inkludert lacrimal, spytt, harderian, svette, prostata og bryst. MECs er en unik celle type som kombinerer et epitel og en glatt muskel fenotype. MECs Express α-glatte muskel utgangen (sma) og har en kontraktile funksjon1,2. I tillegg til MECs, den lacrimal kjertel (LG) og submandibular kjertel (SMG) inneholder SMA + vaskulære celler kalt pericytes, som er celler av endodermal opprinnelse som innhylle overflaten av vaskulære rør3. Selv MECs og pericytes uttrykke mange markører, er sma den eneste markøren som ikke er uttrykt i andre LG og SMG celler1,3.
I løpet av de siste 40 årene har flere laboratorier rapportert om analyser for dissosiasjon av ulike eksokrin kjertel vev, der ikke-enzymatisk og enzymatisk tilnærminger ble anvendt. I en av de første rapportene publisert i 1980, Fritz og medforfattere beskrevet en protokoll for å isolere feline parotid acini bruker sekvensiell fordøyelse i en kollagenase/Trypsin løsning4. I 1989 justerte hann og medforfattere denne protokollen for acini isolering fra rotte LGs ved hjelp av en blanding av kollagenase, Hyaluronidase og DNase5. I 1990 publiserte Cripps og kolleger metoden for ikke-enzymatisk dissosiasjon av lacrimal kjertel acini6. Senere, i 1998, Zoukhri og medforfattere tilbake til en enzymatisk dissosiasjon protokoll for oppfølging ca2 +-IMAGING på LG og SMG isolert acini7. I løpet av det siste tiåret, har forskerne slått sitt fokus på isolering av stilk/stamceller fra eksokrin kjertler. Pringle og medforfattere beskrevet en protokoll i 2011 for isolering av musen SMG stamceller8. Denne metoden var basert på isolering av stilk cellen inneholder salispheres, som ble opprettholdt i kultur. Forfatterne hevdet at voksende celler uttrykker stilk cellen-assosiert markører kan være isolert fra disse salispheres8. Shatos og medforfattere publisert protokollen for stamcelleisolasjon fra uskadet voksen rotte LGs bruker enzymatisk fordøyelsen og samle “frigjort” celler9. Senere, i 2015, Ackermann og medforfattere justert denne prosedyren for å isolere presumptive “murine lacrimal kjertel stamceller” (“mLGSCs”) som kan spres som en mono-lags kultur over flere passasjer10. Men ingen av de før nevnte prosedyrer tillatt for å skille cellulære under typer og individuelle bestander av isolerte epitelceller. I 2016 publiserte Gromova og medforfattere en prosedyre for isolering av LG-stammen/stamceller fra voksen murine LGs ved hjelp av FACS11. Imidlertid var denne protokollen ikke ment å isolere MECs.
Nylig har vi vist at vi er i stand til å isolere SMA + celler fra 3 uke gamle SMA-GFP mus12. Men på dette tidspunktet har vi ikke separert forskjellige populasjoner av SMA + celler. Her etablerte vi en ny prosedyre for direkte isolering av differensiert MECs og pericytes fra voksen LGs og SMGs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskriptet beskrev en protokoll for MEC og pericyte isolering fra LG og SMG. Denne prosedyren var basert på genetisk merking av SMA, den eneste pålitelige biomarkør av MECs og pericytes.
Det haster å utvikle denne protokollen var motivert av nesten totalt fravær av litteratur fremhever isolering av MECs fra murine LGs og SMGs. Selv om genetisk merking ble tidligere brukt, ved hjelp av SMA-GFP mus for å isolere SMA + celler fra unge tre uker gamle LGs12, gj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Ivo Kalajzic for å gi oss med smaCreErt2 musen belastning, Ken Umazume for mus Tailing og genotyperingteknologi, Merk Shelley for å anskaffe profesjonelle bilder for figur 2. Vi takker også Scripps Council of Scientific Redaksjon og Merk Shelley for vitenskapelig engelsk redigering. Vi er takknemlige til The Scripps Research Institute Flow flowcytometri kjerne for hjelp med celle sortering og til Dr. Robin Willenbring for flere diskusjoner/råd om FACS dataanalyse.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 og 1 R01 EY028983 til H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
