Isolering av Myoepithelial celler från Adult murine lacrimal och submandibular körtlar
Summary
Den lacrimal körtel (LG) har två cell typer som uttrycker α-Smooth muskelaktin (αSMA): myoepitelceller (MECs) och pericyter. MECs är av ektodermal ursprung, finns i många körtel vävnader, medan pericyter är vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung. Detta protokoll isolerar MECs och pericyter från murina LGs.
Abstract
Den lacrimal körtel (LG) är en exokrin tubuloacinar körtel som utsöndrar ett vattenhaltigt skikt av tår film. Den LG epitelceller träd består av acinar, duktal epitelial, och myoepithelial celler (mecs). MECs Express alfa glatt muskelaktin (αSMA) och har en kontraktila funktion. De finns i flera körtel organ och är av ektodermal ursprung. Dessutom innehåller LG SMA + vaskulär glatt muskel celler av endodermala ursprung kallas pericyter: kontraktila celler som omger ytan av vaskulära rör. Ett nytt protokoll tillåter oss att isolera både MECs och pericyter från vuxna murina LGs och submandibular körtlar (SMGs). Protokollet är baserat på genetisk märkning av MECs och pericyter med hjälp av SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl mus stam, följt av beredning av LG Single-cell SUS pension för fluorescens AKTIVE rad cell sortering (FACS ). Protokollet tillåter separation av dessa två cell populationer av olika ursprung baserat på uttrycket av epitelial cell adhesionsmolekylen (EpCAM) av MECs, medan pericyter inte uttrycker EpCAM. Isolerade celler kan användas för cell odling eller gen uttrycks analys.
Introduction
Myoepithelial celler (MECs) finns i många exokrin körtlar inklusive lacrimal, salivary, harderian, svett, prostata, och bröst. MECs är en unik cell typ som kombinerar en epitelial och en smidig muskel fenotyp. Mecs Express α-Smooth muskelaktin (SMA) och har en kontraktila funktion1,2. Förutom MECs, den lacrimal körtel (LG) och submandibular körtel (SMG) innehåller SMA + vaskulära celler som kallas pericyter, som är celler av endodermala ursprung som omger ytan av vaskulära rör3. Även om mecs och pericyter uttrycker många markörer, är SMA den enda markör som inte uttrycks i andra LG och SMG-celler1,3.
Inom de senaste 40 åren, flera laboratorier rapporterade analyser för dissociation av olika exokrin körtel vävnader, där icke-enzymatiska och enzymatiska metoder tillämpades. I en av de första rapporter som publicerades i 1980, Fritz och medförfattare beskrev ett protokoll för att isolera felint parotis vindruvor med sekventiell mat smältning i en kollagenas/trypsin lösning4. I 1989, hann och medförfattare justerade detta protokoll för vindruvor isolering från råtta LGs med en blandning av kollagenas, hyaluronidas och DNase5. I 1990, Cripps och kollegor publicerade metoden för icke-enzymatisk dissociation av lacrimal körtel vindruvor6. Senare, i 1998, zoukhri och medförfattare återvände till en enzymatisk dissociation protokoll för att följa upp ca2 +-Imaging på LG och SMG isolerade vindruvor7. Inom det senaste decenniet har forskarna vänt sitt fokus på isolering av stamceller från exokrin körtlar. Pringle och medförfattare beskrev ett protokoll i 2011 för isolering av mus SMG stamceller8. Denna metod baserades på isolering av stamcells-innehållande salispheres, som bibehölls i kultur. Författarna hävdade att prolifererande celler uttrycker stamcells-associerade markörer kan isoleras från dessa salispheres8. Shatos och medförfattare publicerade protokollet för stamcells isolering från oskadade vuxna råtta LGs med enzymatisk mat smältning och samla “befriade” celler9. Senare i 2015, Ackermann och medförfattare justerade detta förfarande för att isolera presumtiva “murina lacrimal körtel stamceller” (“mLGSCs”) som kan spridas som en mono-Layer kultur över flera passager10. Emellertid, ingen av de tidigare nämnda förfaranden som tillåts för att särskilja cellulära subtyper och enskilda populationer av isolerade epitelceller. I 2016, Gromova och medförfattare publicerade ett förfarande för isolering av LG stam/stamceller från vuxna murina LGs använder FACS11. Detta protokoll var dock inte avsett att isolera MECs.
Nyligen har vi visat att vi kan isolera SMA + celler från 3 vecka gamla SMA-GFP möss12. Men vid denna tid har vi inte separerat olika populationer av SMA + celler. Här har vi etablerat ett nytt förfarande för direkt isolering av differentierade MECs och pericyter från vuxna LGs och SMGs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskrev ett protokoll över MEC och pericytbiologi isolering från LG och SMG. Detta förfarande baserades på genetisk märkning av SMA, den enda pålitliga bio markör av mecs och pericyter.
Brådskan att utveckla detta protokoll motiverades av den nästan totala frånvaron av litteratur som belyser isoleringen av MECs från murina LGs och SMGs. Även genetisk märkning användes tidigare, med hjälp av SMA-GFP möss för att isolera SMA + celler från unga tre-veckors-gamla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Ivo Kalajzic för att ge oss med SMACreErt2 mus stam, Takeshi umazume för mus tailing och genotypning, mark Shelley för att förvärva professionella bilder för figur 2. Vi tackar också Scripps råd för vetenskapliga redaktörer och mark Shelley för vetenskaplig engelska redigering. Vi är tacksamma för The Scripps Research Institute Flow Cytometry kärna för hjälp med cell sortering och Dr Robin Willenbring för flera diskussioner/råd om FACS data analys.
Detta arbete stöddes av nationella institut för hälsa, nationella ögon Institute Grants 5 r01 EY026202 och 1 r01 EY028983 till H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
