Yetişkin Murine lacrimal ve submandibular bezlerden Myoepitelyal hücrelerin izolasyonu
Summary
Lakrimal bezi (LG), α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ifade eden iki hücre türüne sahiptir: miyoepitelyal hücreler (MECs) ve perikayt. MECS ektodermal orijinli, birçok glandüler dokularda bulunan, perikayt endodermal kökeni vasküler pürüzsüz Kas hücreleri iken. Bu protokol, murine LGs ‘den MECs ve perikaytları yalıtır.
Abstract
Lakrimal bezi (LG) bir exokrin tubuloacinar bezidir gözyaşı sulu bir tabaka salgılayacağı. LG epitelyal ağacı acinar, duktal epitelyal ve miyoepitelyal hücrelerden (MECs) oluşur. MECs ekspres Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA) ve bir kontril fonksiyonu vardır. Onlar multipl glandüler organlarda bulunan ve ektodermal kökeni vardır. Buna ek olarak, LG içeren SMA + vasküler pürüzsüz Kas hücreleri endodermal kökeni perikayt denilen: damar tüpleri yüzeyini saran kontril hücreler. Yeni bir protokol bize yetişkin duvar LGs ve submandibular bezleri (SMGs) hem MECs ve perikayt izole sağlar. Protokol, SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl fare gerinliği kullanılarak MECS ve perikaytların genetik etiketlemesine dayanmaktadır, ardından floresan aktif hücre sıralama için LG tek hücreli süspansiyonun hazırlanması (FACS ). Protokol, MECs tarafından epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) ifadesine göre farklı Orijinler bu iki hücre nüfusu ayrılması için izin verir, perikayt EpCAM ifade etmez ise. İzole hücreler hücre ekimi veya gen ifadesi analizi için kullanılabilir.
Introduction
Miyoepitelyal hücreler (MECs) lakrimal, tükürük, harderian, ter, prostat ve meme dahil olmak üzere birçok exokrin bezinde bulunur. MECs bir epitelyal ve pürüzsüz bir kas fenotipi birleştiren benzersiz bir hücre türüdür. MECS Express α-pürüzsüz Kas aksini (SMA) ve bir kontril fonksiyonu1,2var. MECs ek olarak, lakrimal bezi (LG) ve submandibular bezi (SMG) içerir SMA + vasküler hücreler perikayt denilen, hangi vasküler tüpler yüzeyini saran endodermal orijinli hücreler3. MECS ve perikayt birçok işaretçileri ifade rağmen, SMA diğer LG ve SMG hücreler1,3ifade edilmez tek Marker.
Son 40 yıl içinde, çeşitli laboratuvarlarda farklı exokrin bezi dokularının dağılımını, enzimatik olmayan ve enzimatik yaklaşımlar uygulandığı bildirildi. 1980 yılında yayımlanan ilk raporlardan birinde, Fritz ve koyazarlar bir collagenase/tripsin çözüm4sıralı sindirim kullanarak kedi parotis acini yalıtmak için bir protokol nitelendirdi. 1989 yılında hann ve koyazarlar, collagenase, hyaluronidaz ve DNase5karışımı kullanılarak sıçan LGS ‘den acini izolasyonu için bu protokolü ayarlamiş. 1990 yılında, Cripps ve meslektaşları lakrimal bezi acini6olmayan enzimatik ayrışma yöntemini yayınladı. Daha sonra, 1998 yılında, zoukhri ve koyazarlar CA2 +-LG ve SMG izole acini7üzerinde görüntüleme takip için bir enzimatik ayrışma protokol döndü. Son on yıl içinde, araştırmacılar exokrin bezlerinden kök/progenitor hücrelerin yalıtım üzerine odak döndü. Pringle ve koyazarlar fare SMG kök hücreleri8yalıtım için 2011 bir protokol nitelendirdi. Bu yöntem, kültürde tutulan kök hücre içeren salispheres yalıtımına dayanmaktadır. Yazarlar, kök hücre ilişkili işaretçileri ifade Proliferasyona hücrelerin bu salispheres izole olabilir iddia8. Shatos ve koyazarlar enzimatik sindirim ve toplama “Kurtarıcı” hücreleri9kullanarak yaralanmamış yetişkin sıçan LGS progenitör hücre yalıtım için protokol yayınladı. Daha sonra, 2015 yılında, Ackermann ve koyazarlar, birden fazla pasajlar10üzerinde mono katmanlı bir kültür olarak yayılabilen “murine lakrimal bezi kök hücreleri” (“mLGSCs”) varsayımsal izole etmek için bu prosedürü ayarlandı. Ancak, önceden bahsedilen prosedürlerin hiçbiri hücresel alt türleri ve izole epitelyal hücrelerin bireysel nüfus ayırt etmek için izin. 2016 yılında, gromova ve yazarları FACS11kullanarak yetişkin murine LGS LG kök/progenitor hücrelerin yalıtım için bir prosedür yayınladı. Ancak, bu protokol MECs yalıtmak için tasarlanmamıştır.
Son zamanlarda, biz SMA + hücreleri yalıtmak mümkün olduğunu göstermiştir 3 hafta-eski SMA-GFP fareler12. Ancak, şu anda biz SMA + hücrelerin farklı nüfus ayrılmış değil. Burada, Yetişkin LGs ve SMGs ‘den farklılaşmış MECs ve perikaytların doğrudan izolasyonu için yeni bir prosedür kurduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, LG ve SMG ‘den MEC ve perikayt izolasyonunun bir protokolü tanımlanmıştır. Bu prosedür, MECs ve perikaytların tek güvenilir biyomarker SMA, genetik etiketleme dayanmaktadır.
Bu protokolü geliştirmeye yönelik aciliyet, edebiyatın neredeyse toplam yokluğunda, murine LGs ve SMGs ‘den MECs izolasyonunu vurgulayarak motive oldu. Genetik etiketleme daha önce kullanılmış olsa da, SMA + hücreleri genç üç haftalık LGs12‘ den izole etmek için S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz SMACreErt2 fare gerilme, fare takip ve genotyping için Takeshi umazume, Şekil 2 için profesyonel resimler elde etmek için Mark Shelley bize sağlamak için Dr Ivo kalajzic teşekkür ederiz. Ayrıca Scientific Ingilizce düzenleme için bilimsel editörler ve Mark Shelley Scripps Konseyi teşekkür ederiz. Biz hücre sıralama ve Dr Robin Willenbring için birden fazla tartışma/FACS veri analizi tavsiyeler için yardım için Scripps Research Institute Flow cytometry çekirdek minnettar.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen, Ulusal göz Enstitüsü hibe 5 R01 EY026202 ve 1 R01 EY028983 H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren’s syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren’s syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. n. d. r. e. w. W., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
