Isolement des cellules myoépithéliales des glandes murines lacrimal et sous-mandibulaires adultes
Summary
La glande lacrymale (LG) a deux types de cellules exprimant l’actine du muscle lisse α (αSMA): les cellules myoépithéliales (CEM) et les périoctets. Les CEM sont d’origine ectodermique, trouvées dans de nombreux tissus glandulaires, tandis que les périoctets sont des cellules musculaires lisses vasculaires d’origine endodermique. Ce protocole isole les CEM et les périoctets des LGs murins.
Abstract
La glande lacrymale (LG) est une glande tubuloacinaire exocrine qui sécrète une couche aqueuse de film lacrymal. L’arbre épithélial LG est composé d’acinar, d’épithélium Ductal et de cellules myoépithéliales (CEM). Les MECs expriment l’actine du muscle lisse alpha (αSMA) et ont une fonction contractile. Ils se retrouvent dans plusieurs organes glandulaires et sont d’origine ectodermique. De plus, le LG contient des cellules musculaires lisses vasculaires SMA + d’origine endodermique appelées périoctets: cellules contractiles qui enveloppent la surface des tubes vasculaires. Un nouveau protocole nous permet d’isoler à la fois les CEM et les périoctets des LGs murins adultes et des glandes sous-mandibulaires (SMGs). Le protocole est basé sur l’étiquetage génétique des CEM et des périoctets à l’aide de la souche de souris SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatofl/fl , suivie par la préparation de la suspension à cellule unique LG pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS ). Le protocole permet la séparation de ces deux populations cellulaires d’origines différentes basées sur l’expression de la molécule d’adhérence des cellules épithéliales (EpCAM) par les CEM, alors que les périoctets n’expriment pas l’EpCAM. Des cellules isolées pourraient être utilisées pour la culture cellulaire ou l’analyse d’expression génique.
Introduction
Les cellules myoépithéliales (CEM) sont présentes dans de nombreuses glandes exocrines, y compris lacrimal, salivaire, Harderian, sueur, prostate et mammaire. Les MECs sont un type de cellule unique qui combine un phénotype épithélial et un muscle lisse. Les mecs expriment l’actine du muscle lisse α (SMA) et ont une fonction contractile1,2. En plus des CEM, la glande lacrymale (LG) et la glande sous-mandibulaire (SMG) contiennent des cellules vasculaires SMA + appelées périoctets, qui sont des cellules d’origine endodermique qui enveloppent la surface des tubes vasculaires3. Bien que les mecs et les périoctets expriment de nombreux marqueurs, SMA est le seul marqueur qui n’est pas exprimé dans d’autres cellules LG et SMG1,3.
Au cours des 40 dernières années, plusieurs laboratoires ont rapporté des essais de dissociation de différents tissus de la glande exocrine, dans lesquels des approches non enzymatiques et enzymatiques ont été appliquées. Dans l’un des premiers rapports publiés en 1980, Fritz et les coauteurs ont décrit un protocole pour isoler les parotides acini félin en utilisant la digestion séquentielle dans une solution de collagénase/trypsine4. En 1989, Hann et les coauteurs ajustaient ce protocole pour isoler les acini des LGs de rats à l’aide d’un mélange de collagénase, de hyaluronidase et de DNase5. En 1990, Cripps et ses collègues ont publié la méthode de dissociation non enzymatique de la glande lacrymal acini6. Plus tard, en 1998, Zoukhri et les coauteurs retournait à un protocole de dissociation enzymatique pour le suivi de l’imagerie ca2 +sur le LG et l’acini isolé de SMG7. Au cours de la dernière décennie, les chercheurs se sont tournés vers l’isolement des cellules souches/progénitrices des glandes exocrines. Les Pringle et les coauteurs ont décrit un protocole en 2011 pour l’isolement des cellules souches de la souris SMG8. Cette méthode était basée sur l’isolement des salisphères contenant des cellules souches, qui ont été maintenues dans la culture. Les auteurs ont affirmé que les cellules proliférantes exprimant des marqueurs associés aux cellules souches pouvaient être isolées de ces salispheres8. Shatos et coauteurs ont publié le protocole pour l’isolement des cellules progénitrices des LGs de rats adultes non blessés utilisant la digestion enzymatique et la collecte des cellules «libérées»9. Plus tard, en 2015, Ackermann et les coauteurs ont ajusté cette procédure pour isoler les «cellules souches de glandes lacrymales» («mLGSCs») qui pourraient être propagées en tant que culture mono-couche sur plusieurs passages10. Cependant, aucune des procédures mentionnées précédemment n’a permis de distinguer les sous-types cellulaires et les populations individuelles de cellules épithéliales isolées. En 2016, Gromova et les coauteurs ont publié une procédure d’isolement des cellules souches/progénitrices de LG à partir de LGs murins adultes utilisant FACS11. Cependant, ce protocole n’était pas destiné à isoler les CEM.
Récemment, nous avons montré que nous sommes en mesure d’isoler les cellules SMA + de 3 semaines de souris SMA-GFP12. Cependant, à ce moment-là, nous n’avons pas séparé différentes populations de cellules SMA +. Nous avons ici établi une nouvelle procédure pour l’isolement direct des CEM et des périoctets différenciés des LGs et des SMG adultes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrivait un protocole d’isolement de MEC et de périoctet de LG et de SMG. Cette procédure était basée sur l’étiquetage génétique de SMA, le seul biomarqueur fiable des CEM et des périoctets.
L’urgence d’élaborer ce protocole a été motivée par l’absence quasi totale de littérature soulignant l’isolement des CEM des LGs murins et des SMGs. Bien que l’étiquetage génétique ait déjà été utilisé, l’utilisation de souris SMA-GFP pour isoler les cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr. Ivo Kalajzic pour nous avoir fourni la souche de souris SMACreErt2 , Takeshi umazume pour le tailing de souris et le génotypage, Mark Shelley pour l’acquisition de photos professionnelles pour la figure 2. Nous remercions également le Conseil des éditeurs scientifiques de Scripps et Mark Shelley pour l’édition scientifique en anglais. Nous sommes reconnaissants au noyau de l’Institut de recherche Scripps Flow cytométrie pour l’aide au tri cellulaire et au Dr Robin Willenbring pour de multiples discussions/conseils sur l’analyse des données FACS.
Ce travail a été appuyé par les instituts nationaux de la santé, les subventions de l’Institut national des yeux 5 R01 EY026202 et 1 R01 EY028983 à H.P.M.
Materials
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 ml Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1000mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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