Summary
Blastocyst biopsi og vitrifikasjon er nødvendig for å effektivt utføre Preimplantation genetisk testing. En tilnærming innebærer den sekvensielle åpningen av Zona pellucida og gjenfinning av 7-8 trophectoderm celler i dag 5-7 post-befruktning begrenser både antall manipulasjoner som kreves og eksponeringen av fosteret til sub-optimale miljøforhold.
Abstract
Blastocyst biopsi er utført for å oppnå en pålitelig genetisk diagnose under IVF sykluser med Preimplantation genetisk testing. Den ideelle arbeidsflyten medfører deretter en sikker og effektiv vitrifikasjon protokoll, på grunn av behandlingstiden for diagnose teknikkene og for å overføre det valgte fosteret (ene) på en fysiologisk endometrium i en påfølgende naturlig syklus. En biopsi tilnærming omfatter sekvensiell åpning av Zona pellucida og gjenfinning av 5-10 trophectoderm celler (ideelt 7-8) begrenser både antall manipulasjoner som kreves og eksponeringen av fosteret til sub-optimale miljøforhold. Etter riktig trening, var teknikken reproduserbar på tvers av ulike operatører i form av timing av biopsi (~ 8 min, alt 3-22 min basert på antall embryo å biopsi per tallerken), avgjørende diagnoser innhentet (~ 97,5%) og leve fødselsrater etter vitrified-varmet euploid blastocyst overføring (> 40%). Overlevelsesraten etter biopsi, vitrifikasjon og oppvarming var så høy som 99,8%. Den re-ekspansjon rate på 1,5 h fra oppvarmingen var så høy som 97%, i stor grad avhengig av timingen mellom biopsi og vitrifikasjon (ideelt ≤ 30 min), blastocyst morfologiske kvalitet og dag med biopsi. Generelt er det bedre å vitrify en kollapset blastocyst; Derfor, i ikke-PGT sykluser, laser-assistert kunstig krymping kan utføres for å indusere embryo kollaps før kryonisk bevaring. Den mest lovende fremtidsperspektiv er ikke-invasiv analyse av IVF kulturen Media etter blastocyst kultur som en antatte kilde til embryonale DNA. Imidlertid er dette potensialet avant-garde fortsatt under etterforskning og en pålitelig protokoll ennå må defineres og validert.
Introduction
Hovedmålet med moderne menneskelig embryologi er å maksimere antall levende fødsler per stimulert syklus og redusere kostnader, tid og innsats for å oppnå en graviditet. For å oppnå dette målet bør det benyttes validerte tilnærminger for embryo-valg for å identifisere reproductively kompetente embryo i en kohort som oppnås under en IVF-syklus. Ifølge de siste bevisene, blastocyst kultur1 kombinert med omfattende kromosom testing og vitrified euploid embryo Transfer (et) er det mest effektive rammeverket for å øke IVF effektivitet2. Åpenbart krever avvik testing en embryonale prøven, som i dag er mest representert fra noen få celler Hentet fra trophectoderm (TE), dvs., den delen av blastocyst som gir opphav til embryo vedlegg (f. eks morkaken) under graviditet . Utover Karyotype analyse, kan også enkelt genmutasjoner vurderes fra en TE biopsi som en del av en klinisk strategi kjent som Preimplantation genetisk testing (PGT;-A for aneuploidies,-SR for strukturelle kromosom rearrangements,-M for monogenic sykdommer). Andre oocyte/embryo biopsi metoder har blitt theorized og vedtatt klinisk over de siste ti årene, nemlig Polar organer biopsi og blastomere biopsi. Imidlertid er bruken redusert i dag siden deres prosessuelle ulemper (f. eks høyere arbeidsmengde og risiko for reproduktiv effekt) og diagnostiske begrensninger (f. eks, enkelt celle analyseproblemer) implisitt hindrer en tilstrekkelig balanse mellom kostnader, risiko og fordeler (for en gjennomgang se3).
I denne utredningen er en av de viktigste protokollene for TE biopsi grundig beskrevet sammen med de påfølgende vitrifikasjon, oppvarming og overføring prosedyrer som kreves. Arbeidsflyten her skissert er ideell for en travel PGT enhet.
Som allerede beskrevet tidligere av vår gruppe4,5, prosedyren innebærer sekvensiell åpning av Zona pellucida av fullt utvidet blastocysts og fjerning av få te celler (i gjennomsnitt 7-8). Sammenlignet med dag 3 laser-assistert klekking-baserte blastocyst biopsi metode6, denne prosedyren kan lette den daglige planen for en IVF enhet hvor delikate prosedyrer, for eksempel blastocyst biopsi og vitrifikasjon, må være betimelig utført. Så snart blastocyst når sin fulle ekspansjon, kan biopsi utføres ved å velge TE cellene å fjerne, og dermed hindre risikoen for herniation av den indre celle massen (ICM), som ellers ville gjøre prosedyren utfordrende. I litteraturen, en tredje protokoll av blastocyst biopsi er også beskrevet, som innebærer laser-assistert klekking utføres når fosteret har allerede nådd blastocyst scenen, noen timer før prosedyren5,7. Denne tilnærmingen er imidlertid mer tidkrevende og passer hovedsakelig IVF-enheter som implementerer TE biopsi i hendene på limitedly erfarne operatører og i lys av en moderat lav daglig arbeidsbelastning.
Intracytoplasmatic sperm injeksjon (ICSI)8 bør være en konsolidert teknikk hvis sikte på å gjennomføre genetiske analyser i IVF. Tilsvarende er en skikkelig kultur system trygt høste embryo til blastocyst scenen er avgjørende for gjennomføringen av TE biopsi strategi. Et tilstrekkelig antall inkubatorer, samt bruk av lav oksygen spenning er viktige forutsetninger for dette formål, for ikke å kompromittere blastocyst rate9. Samtidig er et effektivt kryonisk bevaring-program nødvendig for å administrere en PGT-syklus på en sikker måte. I det siste tiåret, har gjennomføringen av vitrifikasjon økt embryo fryse overlevelse selv opp til > 99%10,11. Dette ga tilstrekkelig tid til å utføre genetisk testing og utsette embryo overføring til følgende menstruasjonssyklus, på en ikke-stimulert og sannsynligvis mer mottakelig endometrium12.
Både TE biopsi og vitrifikasjon er krevende oppgaver som krever strenge ferdigheter og deres effektivitet kan variere mellom uerfarne operatører. En spesifikk opplæringsperiode er derfor til orde for at hver operatør skal kunne utføre disse prosedyrene klinisk; Videre bør vedlikehold av operatørens ferdigheter vurderes periodisk ved å overvåke viktige ytelsesindikatorer (KPI) for kryonisk bevaring og biopsi prosedyrer. Hver IVF klinikk bør sette interne KPIer til dette formål, som må omtrentlige de som er publisert av internasjonale konsortier og/eller resultatene publisert av referanselaboratorier.
TE biopsi, vitrifikasjon-oppvarming og vitne prosedyrer er validert teknikker på vår enhet, som er standardisert på tvers av alle operatørene er involvert som rapportert i tre tidligere publikasjoner11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bare godt erfarne dyktige embryologer som har fullført treningsperioden, skal utføre både TE-biopsi og blastocyst vitrifikasjon. Videre er et vitne kreves for å overvåke prosedyrer og garantere en effektiv sporbarhet under i) bevegelsene til biopsied blastocyst fra biopsi parabolen (supplerende figur 1) til post-biopsi parabolen (supplerende figur 1 ), deretter til vitrifikasjon plate (supplerende figur 1) og til slutt til vitrifikasjon støtte (supplerende …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG og RM samlet inn data og utarbeidet manuskriptet. DC analyserte data, utarbeidet representative resultater, utførte statistikk og revidert manuskriptet. FMU og LR sørget for en kritisk drøfting av resultatene og hele manuskriptet.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
