خزعة الكيسة الكيسية البشرية والتزجيج
Summary
الخزعة الكيسية الكيسية والتزجيج مطلوبان لإجراء اختبارات جينية قبل الزرع بكفاءة. نهج ينطوي على فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 7-8 خلايا التروبسيتوديرم في اليوم 5-7 بعد التلقيح يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون الأمثل.
Abstract
يتم إجراء خزعة الكيسة الكيسية للحصول على تشخيص وراثي موثوق به خلال دورات التلقيح الاصطناعي مع الاختبار الوراثي قبل الزرع. ثم، فإن سير العمل المثالي ينطوي على بروتوكول التزجيج آمنة وفعالة، وذلك بسبب الوقت التحول من تقنيات التشخيص ونقل الجنين (الأجنة) المختارة على بطانة الرحم الفسيولوجية في دورة طبيعية التالية. نهج خزعة يشمل فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 5-10 خلايا التروبسيتوديرم (من الناحية المثالية 7-8) يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون المستوى الأمثل. بعد التدريب المناسب، تم استنساخ هذه التقنية عبر مشغلين مختلفين من حيث توقيت الخزعة (حوالي 8 دقائق، تتراوح 3-22 دقيقة استناداً إلى عدد الأجنة إلى خزعة لكل طبق)، والتشخيصات القاطعة التي تم الحصول عليها (حوالي 97.5٪) ومعدلات المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية النيولويدية الدافئة (> 40٪). وكان معدل البقاء على قيد الحياة بعد خزعة، والتزجيج والاحترار يصل إلى 99.8٪. وكان معدل إعادة التوسع في 1.5 ساعة من الاحترار يصل إلى 97٪، ويعتمد إلى حد كبير على التوقيت بين خزعة والتزجيج (من الناحية المثالية ≤ 30 دقيقة)، ونوعية الكيسة الكيسية المورفولوجية ويوم الخزعة. بشكل عام، فمن الأفضل لvitrify الكيسة الكيسية المنهارة. ولذلك، في دورات غير PGT، يمكن إجراء انكماش اصطناعي بمساعدة الليزر للحث على انهيار الجنين قبل الحفظ بالتبريد. المنظور المستقبلي الواعد هو التحليل غير الغازي لوسائل الإعلام الثقافية التلقيح الاصطناعي بعد ثقافة الكيسة الكيسية كمصدر مفترض للحمض النووي الجنيني. ومع ذلك، لا تزال هذه الطليعة المحتملة قيد التحقيق، ومع ذلك لا بد من تحديد بروتوكول موثوق به والتحقق من صحته.
Introduction
والهدف الرئيسي لعلم الأجنة البشرية الحديثة هو زيادة عدد المواليد الأحياء في كل دورة محفزة إلى أقصى حد وخفض التكاليف والوقت والجهود المبذولة لتحقيق الحمل. ولتحقيق هذا الهدف، ينبغي استخدام نُهُج معتمدة لاختيار الأجنة لتحديد الأجنة المختصة بالإنجاب ضمن مجموعة تم الحصول عليها خلال دورة التلقيح الاصطناعي. وفقا لأحدث الأدلة، ثقافة الكيسة الكيسية1 جنبا إلى جنب مع اختبار الكروموسومات الشاملة ونقل الأجنة euploid المزجج (ET) هو الإطار الأكثر كفاءة لزيادة كفاءة التلقيح الاصطناعي2. ومن الواضح أن اختبار الأنوبلويدي يتطلب عينة جنينية، والتي تمثل في الوقت الحاضر في الغالب من عدد قليل من الخلايا المستردة من التروبسيتوديرم (TE)، أي الجزء من الكيسة الكيسية التي تعطي الأصل لمرفقات الجنين (على سبيل المثال، المشيمة) أثناء الحمل . وإلى جانب تحليل النمط الكاريوبي، يمكن أيضاً تقييم طفرات جينية واحدة من خزعة TE كجزء من استراتيجية سريرية تعرف باسم الاختبارات الجينية قبل الزرع (PGT; -A لداء الأويوبلويدات، -SR لإعادة ترتيب الكروموسومات الهيكلية، -M للأمراض المونوجينية). وقد تم التصورة عن طرق خزعة البويضة/الأجنة الأخرى واعتمدت سريرياً على مدى العقود الماضية، وهي خزعة الأجسام القطبية وخزعة البلابومير. ومع ذلك، فإن استخدامها ينخفض في الوقت الحاضر لأن عيوبها الإجرائية (مثل زيادة عبء العمل وخطر التأثير الإنجابي) والقيود التشخيصية (مثل قضايا تحليل الخلايا الواحدة) تعوق ضمناً تحقيق توازن كاف بين التكاليف والمخاطر و الفوائد (للاطلاع على مراجعة انظر3).
في هذه الورقة، يتم وصف أحد البروتوكولات الرئيسية لخزعة TE بدقة جنبا إلى جنب مع إجراءات التزجيج والاحترار والنقل اللاحقة المطلوبة. سير العمل هنا الموضح مثالي لوحدة PGT مشغول.
كما سبق وصفه من قبل مجموعتنا4،5، ينطوي الإجراء على فتح تسلسلي للبيلوسيدا زونا من الكيسات الكيسية الموسعة بالكامل وإزالة عدد قليل من خلايا TE (في المتوسط 7-8). بالمقارنة مع اليوم 3 بمساعدة الليزر الفقس القائم على الكيسة الكيسية خزعة الأسلوب6، وهذا الإجراء قد يخفف الجدول اليومي لوحدة التلقيح الاصطناعي حيث يجب تنفيذ الإجراءات الدقيقة ، مثل خزعة الكيسة الكيسية والتزجيج ، في الوقت المناسب. بمجرد أن تصل الكيسة الكيسية إلى توسعها الكامل، يمكن إجراء الخزعة عن طريق اختيار خلايا TE لإزالتها، وبالتالي منع خطر فتق كتلة الخلية الداخلية (ICM)، مما يجعل الإجراء صعباً. في الأدب ، تم وصف بروتوكول ثالث من خزعة الكيسة الكيسية أيضا ، والذي ينطوي على إجراء الفقس بمساعدة الليزر بمجرد أن يصل الجنين بالفعل إلى مرحلة الكيسة الكيسية ، قبل ساعات قليلة من الإجراء5،7. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر استهلاكا للوقت ويناسب أساسا وحدات التلقيح الاصطناعي التي تقوم بتنفيذ خزعة TE في أيدي المشغلين ذوي الخبرة المحدودة ونظرا لعبء العمل اليومي المتوسط والمنخفض.
ينبغي أن يكون حقن الحيوانات المنوية داخل التسرّسي (ICSI)8 تقنية موحدة إذا كان الهدف من إجراء التحاليل الوراثية في التلقيح الاصطناعي. وبالمثل، فإن وجود نظام ثقافي مناسب لحصاد الأجنة بأمان إلى مرحلة الكيسة الكيسية الكيسية أمر بالغ الأهمية لتنفيذ استراتيجية خزعة TE. وهناك عدد كاف من الحاضنات، فضلا عن استخدام التوتر الأكسجين المنخفض هي الشروط الأساسية لهذه الغاية، وليس للتنازل عن معدل الكيسة الكيسية9. وفي الوقت نفسه، هناك حاجة إلى برنامج فعال للحفظ بالتبريد لإدارة دورة PGT بأمان. في العقد الماضي، أدى تنفيذ التزجيج إلى زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بالتبريد في الأجنة حتى تصل إلى > 99%10،11. وقد وفر ذلك وقتاً كافياً لإجراء الاختبارات الجينية وتأجيل نقل الأجنة إلى الدورة الشهرية التالية، على بطانة الرحم غير المحفزة وربما الأكثر تقبلاً12.
كل من خزعة TE والتزجيج تتطلب مهام تتطلب مهارات صارمة وفعاليتها قد تختلف عبر المشغلين عديمي الخبرة. ولذلك، يُدعى إلى فترة تدريب محددة قبل السماح لكل مشغل بإجراء هذه الإجراءات سريرياً؛ وعلاوة على ذلك، ينبغي تقييم الحفاظ على مهارات المشغلين بصورة دورية عن طريق رصد مؤشرات الأداء الرئيسية لإجراءات الحفظ بالتبريد والخزعة. وينبغي لكل عيادة من عيادات التلقيح الاصطناعي أن تضع مؤشرات الأداء الرئيسية الداخلية لهذه الغاية، التي يجب أن تُقارب تلك التي تنشرها الاتحادات الدولية و/أو النتائج التي تنشرها المختبرات المرجعية.
يتم التحقق من صحة الخزعة TE، وتسخين التزجيج، وإجراءات المشاهدة في وحدتنا، التي تم توحيدها عبر جميع المشغلين المعنيين كما ورد في ثلاثة منشورات سابقة11،13،14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
فقط علماء الأجنة المهرة ذوي الخبرة الذين أكملوا فترة تدريبهم يجب أن يقوموا بكل من خزعة TE واستئصال الكيسة الكيسية. وعلاوة على ذلك، يطلب من الشاهد رصد الإجراءات وضمان تتبع فعال خلال i) حركات الكيسة الكيسية الخزعية من طبق الخزعة (الشكلالتكميلي1) إلى طبق ما بعد الخزعة (الشكلالتكمي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقامت شركة AG وRM بجمع البيانات وصياغة المخطوطة. وقامت العاصمة بتحليل البيانات، وصياغة النتائج التمثيلية، وإجراء الإحصاءات، وتنقيح المخطوطة. وقدمت جامعة فمو وLR مناقشة نقدية للنتائج وللمخطوطة بأكملها.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
