Биопсия и витрификация человека
Summary
Для эффективного проведения предимплантационного генетического тестирования требуется карангоцистая биопсия и витрификация. Подход, предусматривающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 7-8 трофектодермных клеток в день 5-7 после оплодотворения, ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды.
Abstract
Биопсия Blastocyst выполняется для получения надежной генетической диагностики во время циклов ЭКО с предимплантационным генетическим тестированием. Затем идеальный рабочий процесс влечет за собой безопасный и эффективный протокол витрификации, в связи с временем поворота диагностических методов и переноса выбранного эмбриона (ы) на физиологический эндометрий в следующем естественном цикле. Подход к биопсии, охватывающий последовательное открытие zona pellucida и извлечение 5-10 трофектодермных клеток (в идеале 7-8), ограничивает как количество необходимых манипуляций, так и воздействие эмбриона на неоптимальные условия окружающей среды. После надлежащей подготовки, техника была воспроизводима между различными операторами с точки зрения сроков биопсии (8 мин, в диапазоне 3-22 мин в зависимости от количества эмбрионов к биопсии на блюдо), убедительные диагнозы, полученные (97,5%) и живой коэффициент рождаемости после vitrified-разогретый euploid blastocyst передачи (Зgt;40%). Выживаемость после биопсии, витрификации и потепления составила 99,8%. Скорость повторного расширения на 1,5 ч от потепления была выше, чем 97%, в значительной степени зависит от сроков между биопсией и витрификации (в идеале 30 мин), бластоцист морфологического качества и день биопсии. В общем, лучше vitrify рухнул бластоцист; поэтому в циклах, не связанных с PGT, может быть выполнена лазерная искусственная усадка, чтобы вызвать коллапс эмбриона до криоконсервации. Наиболее перспективной перспективой будущего является неинвазивный анализ средств массовой информации культуры ЭКО после бластоциста культуры в качестве предположительного источника эмбриональной ДНК. Однако этот потенциальный авангард все еще находится в стадии расследования, и еще предстоит определить и утвердить надежный протокол.
Introduction
Основной целью современной эмбриологии человека является максимизация числа живорождений на стимулируемый цикл и сокращение затрат, времени и усилий для достижения беременности. Для достижения этой цели должны быть использованы проверенные подходы к отбору эмбрионов для выявления репродуктивно компетентных эмбрионов в когорте, полученных в ходе цикла ЭКО. Согласно последним данным, бластоцист культура1 в сочетании с комплексным хромосомным тестированием и витрифицированной теплой euploid переносэмбриона эмбриона (ET) является наиболее эффективной основой для повышения эффективности ЭКО2. Очевидно, что тестирование анеуплоидии требует эмбрионального образца, который в настоящее время в основном представлен из нескольких клеток, извлеченных из трофектодерма (TE), т.е. раздела бластоциста, который дает происхождение эмбриона приложения (например, плацента) во время беременности . Помимо анализа кариотипа, также мутации одного гена могут быть оценены из биопсии Т как часть клинической стратегии, известной как предимплантационное генетическое тестирование (PGT; -A для анеуплоидий, -SR для структурных хромосомных перестановок, -M для моногенных заболеваний). Другие методы биопсии яйцеклеток/эмбрионов были теоретизированы и приняты клинически на протяжении последних десятилетий, а именно биопсия полярных тел и биопсия бластомеров. Однако их использование в настоящее время сокращается, поскольку их процедурные недостатки (например, более высокая рабочая нагрузка и риск для репродуктивного воздействия) и диагностические ограничения (например, вопросы анализа одной ячейки) неявно препятствуют достаточному балансу между издержками, рисками и льготы (для обзора см.3).
В этой работе один из основных протоколов биопсии TE тщательно описан вместе с последующими процедурами витрификации, нагревания и передачи. Рабочий процесс здесь изложены идеально подходит для занят PGT единицы.
Как уже описано ранее нашей группой4,5, процедура включает в себя последовательное открытие zona pellucida полностью расширенных бластоцистых и удаление нескольких тЭцклеток (в среднем 7-8). По сравнению с днем 3 лазерной помощи штрихучийметод биопсии 6, эта процедура может облегчить ежедневный график ЭКО единицы, где деликатные процедуры, такие как бластоциста биопсии и витрификации, должны быть своевременно выполнены. Как только бластоцист достигает своего полного расширения, биопсия может быть проведена путем выбора т.д. клеток для удаления, тем самым предотвращая риск грыжи внутренней клеточной массы (ICM), что в противном случае сделать процедуру сложной. В литературе, третий протокол бластоциста биопсии также был описан, который включает в себя лазерной помощи штриховки осуществляется после эмбриона уже достигли стадии бластоциста, за несколько часов до процедуры5,7. Однако этот подход занимает больше времени и в основном подходит для единиц ЭКО, которые внедряют биопсию TE в руках малоопытных операторов и с учетом умеренно-низкой ежедневной рабочей нагрузки.
Интрацитоплазматическая инъекция спермы (ICSI)8 должна быть консолидированной техникой, если она направлена на проведение генетического анализа при ЭКО. Аналогичным образом, надлежащая система культуры для безопасного сбора эмбрионов до стадии бластоциста имеет решающее значение для осуществления стратегии биопсии TE. Достаточное количество инкубаторов, а также использование низкого уровня кислородного напряжения являются ключевыми предпосылками для этого, чтобы не скомпрометировать бластоциста скорость9. В то же время, эффективная программа криоконсервации необходима для безопасного управления циклом PGT. В последнее десятилетие, внедрение витрификации увеличила эмбрион крио-выживаемости даже до йgt;99%10,11. Это обеспечило достаточно времени для выполнения генетического тестирования и отложить перенос эмбриона на следующий менструальный цикл, на нестимулируемый и, вероятно, более восприимчивый эндометрий12.
Биопсия TE и витрификация требуют выполнения задач, требующих строгих навыков, и их эффективность может варьироваться в зависимости от неопытных операторов. Поэтому проводится специальный учебный период, прежде чем позволять каждому оператору проводить эти процедуры клинически; кроме того, необходимо периодически оценивать повышение квалификации операторов путем мониторинга ключевых показателей эффективности (КПИ) для процедур криоконсервации и биопсии. Каждая клиника ЭКО должна установить внутренние KPI для этой цели, которые должны приблизитьте те, опубликованные международными консорциумами и / или результаты, опубликованные справочными лабораториями.
TE биопсии, витрификации потепления и свидетельские процедуры являются проверенными методами в нашем подразделении, которые были стандартизированы во всех операторов, участвующих, как сообщалось в трех предыдущих публикациях11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Только опытные опытные эмбриологи, прошедшие свой учебный период, должны выполнять как биопсию TE, так и витрификацию бластоциста. Кроме того, свидетель обязан контролировать процедуры и гарантировать эффективную прослеживаемость во время i) движения биопсии бластоциста из биопсии блю…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG и RM собрали данные и составили рукопись. УК проанализировала данные, составила репрезентативные результаты, выполнила статистику и пересмотрела рукопись. FMU и LR обеспечили критическое обсуждение результатов и всей рукописи.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
