Summary
A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.
Abstract
A biópsia do Blastocyst é executada para obter um diagnóstico genético de confiança durante ciclos de IVF com teste genético do pré-implante. Em seguida, o fluxo de trabalho ideal implica um protocolo de vitrificação seguro e eficiente, devido ao tempo de resposta das técnicas diagnósticas e à transferência do (s) embrião (es) selecionado em um endométrio fisiológico em um ciclo natural seguinte. Uma aproximação da biópsia que abrange a abertura seqüencial do pelúcida da zona e a recuperação de 5-10 pilhas do trofectoderma (idealmente 7-8) limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal. Após o treinamento adequado, a técnica foi reprodutível em diferentes operadores em termos de tempo de biópsia (~ 8 min, variando de 3-22 min com base no número de embriões para biópsia por prato), diagnósticos conclusivos obtidos (~ 97,5%) e taxas de natalidade ao vivo após a transferência de blastocisto de euplóide vitrificado-aquecido (> 40%). A taxa de sobrevida após biópsia, vitrificação e aquecimento foi tão alta quanto 99,8%. A taxa da re-expansão em 1,5 h do aquecimento era tão elevada quanto 97%, pela maior parte dependente do sincronismo entre a biópsia e a vitrificação (idealmente ≤ 30 minutos), a qualidade morfológica do blastocisto e o dia da biópsia. Em geral, é melhor vitrificar um blastocist colapsado; Conseqüentemente, em ciclos da não-PGT, o encolhimento artificial laser-ajudado pôde ser executado para induzir o colapso do embrião antes da criopreservação. A perspectiva futura a mais prometedora é a análise não invasora dos meios de cultura do IVF após a cultura do blastocisto como uma fonte putativo do ADN embrionário. No entanto, este potencial avant-garde ainda está investigação e um protocolo confiável ainda precisa ser definido e validado.
Introduction
O principal objetivo da embriologia humana moderna é maximizar o número de nascidos vivos por ciclo estimulado e reduzir custos, tempo e esforços para conseguir uma gravidez. Para atingir esse objetivo, devem ser empregadas abordagens validadas para a seleção de embriões para identificar embrião reproductivamente competentes dentro de uma coorte obtida durante um ciclo de FIV. De acordo com as evidências as mais atrasadas, a cultura1 do blastocisto combinada com o teste cromossomático detalhado e transferência Vitrified-aquecida do embrião do ADN (et) é a estrutura a mais eficiente para aumentar a eficiência2de IVF. Claramente, o teste de aneuploidia requer um espécime embrionário, que presentemente é representado na maior parte de poucas pilhas recuperadas do trofectoderma (te), isto é, a seção do blastocisto que dá a origem aos anexos do embrião (por exemplo, a placenta) durante a gravidez . Além da análise do karyotype, também as únicas mutações genéticas puderam ser avaliadas de uma biópsia do te como parte de uma estratégia clínica conhecida como o teste genético do preimplante (PGT;-a para aneuploidies,-Sr para rearranjos cromossomáticos estruturais,-M para doenças monogênica). Outros métodos da biópsia do oocyte/embrião foram teorized e adotados clìnica através das últimas décadas, a saber biópsia dos corpos polares e biópsia do blastômero. No entanto, a sua utilização é reduzida nos dias de hoje, uma vez que as suas desvantagens processuais (por exemplo, maior carga de trabalho e risco de impacto reprodutivo) e limitações diagnósticas (por exemplo, problemas de análise de células únicas) impedem implicitamente um equilíbrio suficiente entre custos, riscos e benefícios (para uma revisão ver3).
Neste trabalho, um dos principais protocolos para a biópsia TE é completamente descrito juntamente com os procedimentos subsequentes de vitrificação, aquecimento e transferência necessários. O fluxo de trabalho aqui descrito é ideal para uma unidade PGT ocupada.
Como já descrito anteriormente pelo nosso grupo4,5, o procedimento envolve a abertura sequencial da zona pelúcida de blastocistos totalmente expandidos e remoção de poucas células te (em média 7-8). Comparado ao dia 3 laser-ajudado a incubação-baseou o método6da biópsia do blastocisto, este procedimento pôde facilitar a programação diária de uma unidade de IVF onde os procedimentos delicados, tais como a biópsia e a vitrificação do blastocisto, devam ser executados oportuna. Assim que o blastocisto alcança sua expansão cheia, a biópsia pode ser realizada selecionando as pilhas do te a remover, assim impedindo o risco do herniation da massa interna da pilha (ICM), que de outra maneira tornaria o procedimento desafiante. Na literatura, um terceiro Protocolo da biópsia do blastocisto foi descrito igualmente, que envolva o incubação laser-ajudado que está sendo executado uma vez que o embrião já alcangou o estágio do blastocisto, poucas horas antes do procedimento5,7. Entretanto, esta aproximação é mais demorada e sere principalmente as unidades de IVF que estão implementando a biópsia do te nas mãos de operadores limitadamente experimentados e em vista de uma carga de trabalho diária moderada-baixa.
A injeção intracytoplasmatic do esperma (ICSI)8 deve ser uma técnica consolidada se visando conduzir análises genéticas em IVF. Da mesma forma, um sistema de cultura adequado para a colheita segura de embriões para o estágio de blastocist é crucial para a implementação da estratégia de biópsia de TE. Um número adequado de incubadoras, bem como o uso de baixa tensão de oxigênio são pré-requisitos chave para este fim, para não comprometer a taxa de blastocist9. Ao mesmo tempo, um programa de criopreservação eficiente é necessário para gerenciar com segurança um ciclo de PGT. Na última década, a implantação da vitrificação impulsionou as taxas de criosobrevivência embrionária até > 99%10,11. Isso proporcionou tempo suficiente para realizar testes genéticos e adiar a transferência de embriões para o seguinte ciclo menstrual, em um endométrio não estimulado e provavelmente mais receptivo12.
Tanto a biópsia de TE quanto a vitrificação são tarefas exigentes que exigem habilidades rigorosas e sua eficácia pode variar em operadores não experientes. Um período de formação específico é, portanto, defendido antes de permitir que cada operador realize estes procedimentos clinicamente; Além disso, a manutenção das competências dos operadores deve ser avaliada periodicamente através da monitorização dos indicadores-chave de desempenho (KPI) para os procedimentos de criopreservação e biópsia. Cada clínica de fertilização in vitro deve definir KPIs internos para esse fim, que devem aproximar os publicados por consórcios internacionais e/ou os resultados publicados por laboratórios de referência.
Os procedimentos de biópsia, vitrificação-aquecimento e testemunhando são técnicas validadas em nossa unidade, que foram padronizadas em todos os operadores envolvidos, conforme relatado em três publicações anteriores11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Somente os embriologistas hábeis bem experientes que concluíram seu período de treinamento devem executar a biópsia do te e a vitrificação do blastocisto. Além disso, uma testemunha é exigida para monitorar os procedimentos e para garantir uma rastreabilidade eficiente durante i) os movimentos do blastocisto biópsia do prato da biópsia (Figura complementar 1) ao prato da borne-biópsia (Figura 1 suplementar ), depois à placa de vitrificação (Figura 1 suplementar</str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A AG e a RM coletaram os dados e elaboraram o manuscrito. A DC analisou os dados, elaborou os resultados representativos, realizou as estatísticas e revisou o manuscrito. A FMU e a LR forneceram discussão crítica dos resultados e de todo o manuscrito.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
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