Summary
אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.
Abstract
כל poxvirus משוכפל לאחר שכפול ה-DNA נגיפי יש שימור אבולוציונית, לא בתבניות 5 '-פולי (A) מנהיג 5 '-UTR. כדי לנתח את התפקיד של 5 '-פולי (A) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus פיתחנו בתוך מתורבת מבוסס RNA הכתב ללוציפראז הכתבת. כתבת זו מהווה כוללת של ארבעה צעדי ליבה: (1) ה-PCR כדי להגביר את תבנית הדנ א לתמלול של מבחנה; (2) בתמלול מבחנה כדי ליצור mRNA באמצעות T7 RNA פולימראז; (3) העברה בכדי להחדיר מחוץ לגופית mRNA לתוך תאים; (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום. ה-RNA המבוסס על כתבת לוציפראז המתוארת תיאר כאן בעיות של שכפול פלשבאמצע בתאים נגועים poxvirus ושעתוק מסתורית מן הפלביניים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את רגולציה של התרגום על ידי cis-אלמנטס ב-mrna כולל 5 '-utr ו-3 '-utr במערכות שאינן תאים נגועים poxvirus. יתר על כן, מצבים שונים של חניכה התרגום כמו כובע תלוי, כובע עצמאי, חניכה מחדש, וחניכה פנימית ניתן לחקור באמצעות שיטה זו.
Introduction
על פי הדוגמה המרכזית, מידע גנטי זורם מ-DNA ל-RNA ולבסוף חלבון1,2. זרם זה של מידע גנטי מוסדר מאוד ברמות רבות כולל התרגום mrna3,4. פיתוח הכתב הקובע למדידת ביטוי הגנים יקל על ההבנה של מנגנוני הרגולציה המעורבים בתהליך זה. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד תרגום mrna באמצעות מחוץ לבית מתורבת מבוסס RNA כתבת ללוציפראז הכתבת בתאים הנגועים poxvirus.
Poxviruses מהווים רבים מאוד מסוכן אדם ופתוגנים בעלי חיים5. כמו כל הווירוסים האחרים, poxviruses להסתמך בלעדית על מכונות תא מארח עבור סינתזה חלבון6,7,8. כדי לסנתז ביעילות חלבונים ויראליים, וירוסים התפתחו אסטרטגיות רבות כדי לחטוף מכונות translational סלולרית כדי לנתב אותו לתרגום mrnas ויראלי7,8. מנגנון אחד המועסקים בדרך כלל על ידי וירוסים הוא להשתמש באלמנטים cis-משחק התעתיקים שלהם. הדוגמאות הבולטות כוללות את האתר הפנימי ריבוכמה כניסה (IRES) ומשפר תרגום עצמאית כובע (לצטט)9,10,11. אלה רכיבי ציסלהפוך את התעתיקים הנגיפי יתרון טרנסלtional על ידי משיכת מכונות translational באמצעות מנגנונים שונים12,13,14. מעל 100 poxvirus mrnas יש מרכיב שמור לגמרי cis-משחק באזור 5 '-untranslated (5 '-utr): 5 '-פולי (א) מנהיג ב 5 ' הקצוות של אלה mrnas15,16. האורכים של אלה 5 '-פולי (א) מנהיגים הם הטרוגנית ומופקים על ידי החלקה של רנ א poxvirus מקודד RNA פולימראז במהלך שעתוק17,18. אנחנו, ואחרים, לאחרונה גילו כי 5 '-פולי (A) מנהיג לקיים יתרון תרגום ל mrna בתאים נגוע vaccinia וירוס (vacv), חבר פרוטוטיפקס של poxviruses19,20.
בשנת מחוץ לחוק העתק RNA המבוסס הכתב ללוציפראז פותחה בתחילה כדי להבין את התפקיד של 5 '-פולי (א) מנהיג ב-mrna תרגום במהלך זיהום poxvirus19,21. למרות בסיס DNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז שימוש נרחב, ישנם החסרונות מספר כי יהיה לסבך את פרשנות התוצאה בתאים נגועים poxvirus. ראשון, פלמידים מסוגלים לשכפל בתאים נגועים VACV22. שנית, שעתוק מוזר מתרחש לעתים קרובות בשנת DNA מפלסטיק18,23,24. שלישית, שעתוק מונחה המקדם של VACV מייצר פולי (א)-מנהיג האורכים הטרוגנית ובכך קשה לשלוט באורך המוביל של המנהיג בכמה ניסויים18. A ב מתורבת מבוסס RNA המבוסס העיתונאי ללוציפראז בעיות אלה ופרשנות הנתונים הוא פשוט.
ישנם ארבעה שלבים מרכזיים בשיטה זו: (1) התגובה שרשרת פולימראז (PCR) כדי ליצור את תבנית ה-DNA עבור תמלול של מבחנה; (2) בתמלול מתורבת להפקת mRNA; (3) העברה כדי לספק mRNA לתוך תאים; ו (4) זיהוי של פעילות לוציפראז כאינדיקטור לתרגום (איור 1). ה-PCR אמפליקון מכיל את האלמנטים הבאים ב 5 ' עד 3 כיוון: T7-יזם, פולי (A) מנהיג או המבוקש 5 '-utr רצף, גחלילית ללוציפראז פתח מסגרת קריאה (orf) ואחריו הזנב פולי (A). ה-PCR אמפליקון משמש כתבנית לסנתז mrna על ידי תמלול מחוץ לחומרים באמצעות T7 פולימראז. במהלך שעתוק מחוץ לחומרים מסוימים, כובע מז7גרם או כובע אנלוגי אחר משולב ב-mrna החדש מסונתז. התעתיקים הוכתרים מתגברים לתוך. תאים נגועים או מזוהמים בשואב אבק ליפוסט התא נאסף בזמן הרצוי לאחר החצייה כדי למדוד פעילויות לוציפראז המציינות ייצור חלבון מ mRNA מזוהמים. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי ללמוד את התקנת התרגום של הרכיב cis-הנוכחי ב-5 '-utr, 3 '-utr או אזורים אחרים של mrna. יתר על כן, מחוץ למבחנה מבוססת RNA מבוססי שימוש ניתן להשתמש כדי ללמוד מנגנונים שונים של ייזום התרגום כולל חניכה תלוי כובע, חניכה כובע עצמאי, ייזום מחדש וחניכה פנימית כמו IRES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR עבור תמלול והפריה חוץ גופית
- כדי להכין את תבנית הדנ א. של ה-PCR, עיצוב התחל כאשר עיצוב התחל לשקול מאפיינים קריטיים כמו באורך פריימר, ריפוי טמפרטורה (Tm), GC תוכן, 3 ' לסיים עם G או C וכו '.
הערה: דנו בפרטים בספרות. הזאת25,26,27 - עיצוב התחל לייצר אמפליקון PCR המכיל את האלמנטים הבאים 5 ' כדי 3 ' כיוון: T7-יזם, פולי (א) מנהיג, גחלילית ללוציפראז orf ו פולי (a) הזנב המכונה להלן T7_12A-fluc. עיצוב התחל (קדימה ואחורה) כדי להקיף את כל הרכיבים הנוספים שאינם נמצאים ב-DNA של התבנית (איור 2A).
הערה: הרצף של כל הרכיבים ניתן למצוא בטבלה 1. - כלול מספר נוקלאוטידים נוספים בפריימר קדימה (5 '-3 ')28, ואחריו T7-יזם, פולי (A) מנהיג או הרצוי 5 '-הרצף utr ו 20 נוקלאוטידים, להתאים מבוסס על Tm, המתאים לקצה 5 ' של הגן של העיתונאי ORF. ודאו שהאזור המקביל בתחל זהה לחוט התחושה (+ סטרנד) של הגן.
הערה: עבור ארוך 5 '-UTR, לסנתז שני שברי DNA: אחד עם T7 יזם ואחריו 5 '-UTR ושנית עם הגן של העיתונאי ORF. הצטרפו לשני הקטעים הללו באמצעות הרחבה החופפת PCR29. - עיצוב הפוך לאחור (5 '-3 ') כדי לכלול את הזנב פולי (A) ו כ 20 נוקלאוטידים, להתאים בהתבסס על Tm, המתאים לסוף 3 ' של הגן של העיתונאי orf. להבטיח את האזור המתאים בתחל זהה החוט האנטי תחושה (-סטרנד) של הגן ו מסגרת לעצור קודון הוא נוכח לפני פולי (א) זנב.
הערה: האורך הרצוי של A ב פולי (א) מנהיג או פולי (א) הזנב ניתן להתאים אישית את התחל. לדוגמה, כדי להוסיף 50 A בזנב פולי (A), ההילוך האחורי צריך להיות כרוך 50 של. באופן דומה, כדי להוסיף 20 א ' s במנהיג פולי (א), התחל הקדמי צריך להיות כרוך 20 A. - עבור שליטה פנימית, עיצוב מערכת אחרת של תחל המכיל את האלמנטים הבאים 5 ' כדי 3 ' כיוון: T7 יזם, אקראי 5 '-utr קידוד רצף המכיל את הרצף kozak, renilla ללוציפראז orf ו פולי (א) הזנב התייחס להלן כמו T7_ . קוז'אק-רילוק
- בצינור ה-PCR, מוסיפים את הריאגנטים בסדר הבא: dnase מים בחינם, 2x באיכות גבוהה dna פולימראז, התחל, ורצף אישר ללוציפראז תבנית DNA (שולחן 2).
הערה: יש לכוונן כמויות של רכיבים בודדים בתערובת בהתאם לעוצמת התגובה. - השתמש במחזור ה-PCR הסטנדרטי 3-שלב (דנטורציה, ריפוי, הארכה) כדי ליצור תבנית DNA כפי שמוצג בטבלה 3.
הערה: הטמפרטורה ריפוי X ° צ' תלוי התחל להגדיר לשמש זמן הארכה T min תלוי ב-PCR אמפליקון גודל ו-DNA פולימראז בשימוש. - לזהות את מוצר ה-PCR על ידי הפעלת 5-10% מתגובת ה-PCR ב-1% הצמח Tris-אצטט-EDTA (טה) ג'ל (המכיל 0.1 μg/ml אתידיום ברומיד) יחד עם תקן מולקולרי זמין מבחינה מולקולרית משקל. דמיינו את הג תחת מאייר UV כדי לקבוע את הגודל של מוצר ה-PCR.
- לאחר קביעת הגודל הנכון של מוצר ה-PCR, ~ 1.7 kb עבור T7_12A-Fluc ו-~ 1.0 kb עבור T7_Kozak-Rluc, לטהר אותו באמצעות ערכת טיהור מסחרית של PCR. Elute ה-DNA באמצעות 100 μL החכירה מים חינם (איור 2B).
- פעם מטוהר, לבדוק את הריכוז של ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה ולקבוע את A260/A280 יחס (~ 1.8-2.0 הוא מקובל).
- החנות DNA מטוהרים ב-20 ° c או להשתמש בתמלול מבחנה באופן מיידי.
2. יצירת mRNA על ידי תמלול מחוץ לחומרים
-
סנתז RNA ממוצר ה-PCR, באמצעות ערכת שעתוק מחוץ למערכת (איור 3 א).
הערה: T7_12A-fluc ו-T7_Kozak-rluc תבניות DNA משמשות לסנתז 12A-Fluc ו-Kozak-Rluc mRNAs, בהתאמה.- כדי לעשות זאת, לקחת שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף את הריאגנטים בסדר הבא: DNase-RNase מים ללא תשלום, מאגר NTP ערבוב, כובע אנלוגי, תבנית PCR המוצר, T7-RNA פולימראז שילוב (שולחן 4).
הערה: מערכות הגבלה אחרות יכול לשמש גם כדי כובע RNA ברצף לאחר שעתוק מחוץ לתחום ההוראה של היצרן. - מערבבים ביסודיות ומודגרות ב 37 ° c עבור 2 h.
- המשך לטיהור של רנ א מסונתז באמצעות ערכת טיהור RNA.
- כדי לעשות זאת, לקחת שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף את הריאגנטים בסדר הבא: DNase-RNase מים ללא תשלום, מאגר NTP ערבוב, כובע אנלוגי, תבנית PCR המוצר, T7-RNA פולימראז שילוב (שולחן 4).
- הפעל מטוהרים RNA ב 1.5% agarose Tris-borate-EDTA (להיות) ג'ל (מכיל 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד) כדי לבדוק את RNA. דמיינו את הג תחת מאייר אולטרא סגול (איור 3B).
- בדוק את הריכוז של ה-RNA באמצעות ספקטרוסקופיה ולקבוע A260/A280 יחס (~ 1.8-2.0 הוא מקובל).
- הורדה של ה-RNA הטהור והחנות ב-80 ° c.
3. העברה של mRNA לתאים
- זרע חלה תאים בצלחת 24-הבאר (כדי להיות כ. ~ 80-90% confluent ביום המחרת) ו דגירה לילה בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
- להדביק תאי הלה עם וירוס vaccinia (VACV) בריבוי של זיהום (ממוי) של 5 או לשמור על תאי הלה נגוע להשוואה.
הערה: מע הוא מספר החלקיקים הנגיפי הדבקים לכל תא. - מו של X = {[(מספר התאים * X)/וירוס Titer] * 1000} μl של וירוס למדיום 1 mL.
-
לאחר הצורך לפוסט זיהום (hpi) (בניסוי זה ב 10-12 hpi), transfect mRNA (500 ng הכולל של mRNA לכל טוב של 24-ובכן צלחות) באמצעות מגיב שומנים ליפיד התגובה כפי שמוצג באיור 3C.
- עבור אחד טוב של צלחת 24-הבאר, לערבב 480 ng של 12A רצף הנושאת גחלילית לוציפראז (12A-Fluc) mRNA ו 20 ng של הרצף של קוזק הנושאת Renilla לוציפראז (Kozak-Rluc) mrna בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחרת להוסיף 1.1 μL של מגיב שומנים בשיטת השומנים.
- הוסף 55 μL של מדיום סרום מופחת בשני הצינורות. מערבבים ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
- לאחר 5 דקות של דגירה, להוסיף 55 μL מגיב שומנים בשיטת השומנים המכילים סרום מופחת בינוני mRNA המכיל צינור.
- מערבבים בעדינות אך ביסודיות, ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
- במהלך הדגירה, להסיר את מדיום התרבות התא ולהוסיף 400 μL של בינוני סרום מופחת לכל טוב של לוחיות 24-טוב.
- לאחר הדגירה, להוסיף 100 μL של התערובת ה, ובאופן שווה לאחד הבאר של 24 לוחות היטב.
4. מידה הלוציפראז פעילויות
- חמש שעות שלאחר שיתוף הפעולה של 12a-fluc ו kozak-rluc mrna, למדוד פעילות לוציפראז באמצעות מערכת שיטת לוציפראז מסוגל לבצע שני כתבת בחני (g., כפול לוציפראז הכתב מערכת).
- הסר את המדיום סרום מופחת ולאחר מכן את התאים על ידי הוספת 150 μl 1x מאגר הליזה, רכיב של ערכת שיטת ללוציפראז.
- לאחר 10 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, לאסוף את הליפוסט על ידי העברת התאים ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה את ליפוסט ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי פסולת תא גלולה.
- הוסף 30 μL של סופרנטנט באטום לקיר 96 היטב לוחית שיטת לבנים עם תחתית מוצקה.
- למדוד את האור הכפול באמצעות ערכת התכונות לוציפראז ומדידת מהירות קורא לוחית רב במצב.
- בצע את המדידה באמצעות פונקציית קינטיקה (על בסיס כל הטוב) באמצעות ההגדרות המתוארות בטבלה 5.
הערה: הקריאה יכולה להילקח גם באמצעות לומימטר ידני. הוסף נפח שווה של ליפוסט ומצע עבור Fluc ב קובט. לחכות 2 s ולמדוד עבור 10 s באמצעות לומימטר. בעקבות מדידה Fluc, במהירות להוציא קובט מלומטר ולהוסיף נפח שווה של המצע עבור Rluc ידנית. שוב, לחכות 2 s ולמדוד עבור 10 s באמצעות לומימטר. - ייצוא נתוני קריאת האור לתבנית קובץ רצויה.
- קבע את קצב התרגום היחסי מ-12A-Fluc mRNA בתאי הלה נגוע VACV על-ידי חלוקת ערך Fluc על-ידי ערך Rluc השליטה הפנימית.
הערה: איור משלים 1 מציג את הניתוח שלב אחר שלב של נתונים גולמיים כדי לקבל פעילות fluc יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ארבעת השלבים של בשנת מתורבת מועתק RNA מבוססי כתבת לוציפראז: ה-PCR כדי ליצור תבנית DNA עבור תמלול שעתוק, בתמלול חוץ גופית כדי ליצור mRNA, העברה mRNA, ו לוציפראז מדידה, ניתן לראות בתרשים סכימטי ( איור 1). עיצוב התחל עבור שתי תבניות ה-DNA (fluc ו rluc) ואת הערכה הכללית של הארכה סככה מומחש התרשים (איור 2a). לאחר ה-PCR, המוצר הנכון PCR התגלה על ידי אלקטרופורזה בג של טאי-ג'ל (איור 2B). לאחר מכן, מוצר ה-PCR משמש כתבנית לסנתז RNA בתוך מבחנה (איור 3A), שהוא מטוהר ומופעל באלקטרופורזה ב-tbe ג'ל כדי לאמת את הגודל (איור 3a). MRNA מטוהר ומאומת הוא מנוכר לתוך התאים באמצעות מגיב השומנים ליפיד (איור 3C). השימוש התחל בפרוטוקול זה מופיע בטבלה 6.
בשנת מתורבת העתק RNA מבוססי לוציפראז העיתונאי פותחה כדי להבין את התפקיד של 5 '-פולי (A) מנהיג ב-mRNA תרגום במהלך זיהום poxvirus. באמצעות השיטה הזו, בדקנו את יעילות התרגום של Fluc mRNA המכיל 5 '-פולי (A) מנהיג (12 nt) בתאים נגועים ו-VACV נגוע. הערך Fluc היה מנורמל באמצעות ערך Rluc בתאים נגועים ו-VACV נגוע כדי לקבוע את הפעילות Fluc יחסית (כלומר הפעילות Fluc/Rluc פעילות) (איור 4A). החטיבה של Fluc על ידי Rluc מנורמלת את היעילות ואת יציבות RNA בבאר מסוימת. באמצעות גישה זו ניתוח, קבענו כי 5 '-פולי (A) מנהיג המכיל mRNA יש יתרון טרנסלtional במהלך זיהום VACV (איור 4B). היתרון בתאים נגועים לא היה בשל יעילות האיזון הדיפרנציאלי או היציבות mRNA כמו ברמת RNA היה דומה נגוע בתאים נגוע VACV 5 h שלאחר העבר mRNA הזיהום19.
איור 1: סכימטי של ההליך הניסיוני. ה-PCR משמש להפקת תבנית DNA עם האלמנטים הרצויים. mRNA קידוד גן הכתבת לוציפראז הוא מסונתז בתוך מבחנה באמצעות T7 RNA פולימראז מבוסס מערכת. לוציז גחלילית (Fluc) mRNA הוא שיתוף העברה עם מילה של Renilla הלוצ (Rluc) mRNA אל נגוע או התאים הנגועים VACV. פעילויות לוציפראז נמדדות באמצעות לומימטר עם יכולת לוציפרראז כפולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פריימר עיצוב ו-PCR מבוססי ה-DNA הגברה. (א) הקדמי קדימה מסונתז כוללים רצף אקראי של 8nt, T7 יזם ואחריו 5 '-utr הרצוי וחלק 5 ' הקצה של הגן העיתונאי לוציפראז, בעוד פריימר הפוכה כולל T-בדרכי ליצור פולי (א) זנב ואת 3 ' סוף ה . גן הכתבים הלוציפראז על ידי הארכת הארכה PCR באמצעות תבנית פלאבאמצע המכילה גן לוציפראז, תבנית DNA נוצרת. (ב) להקת דנ א של הגודל הרצוי מתגובת ה-PCR זוהתה באמצעות 1% האלקטרופורזה בג ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סינתזה והזיהום של mRNA. (א) סכמטי של תמלול מבחנה. דנ א מוגבר על ידי ה-PCR המכיל את הגן לוציפראז במורד מן 5 '-UTR של הריבית ואת היזם T7 משמש כתבנית. T7 RNA פולימראז מגויס ליזם ומוסיף ribonucleotides, המוצג לבן, מ 5 ' עד 3 ' כיוון. לאחר mRNA הוא 25-30 nt ארוך, m7כובע G מתווסף באמצעות כובע אנטי הפוכה אנלוגי, מארקה. (ב) להקות RNA מתוך תמלול וכלי מבחנה שאותרו באמצעות 1.5% מהאלקטרופורזה ב-gel-ג'ל. (ג) סכמטי מפגין את הזיהום של הכתב mrna לתאים. בינוני המכיל את הכתבת mRNA או להבחנות השומנים מגיב בצינורות נפרדים מותר לבטליאט בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. הפתרונות מעורבבים לאחר מכן על ידי דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות לאחר אשר התערובת הכימית RNA/העברה מתווסף לתאים בלוחות התרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדלת יעילות הטרנסללית של mRNA המכילה מנהיג של 5-פולי (a). (A) Fluc mrna המכיל מנהיג פולי (a) ב 5 '-utr ו Rluc mrna עם רצף הקונצנזוס של קוזק ב 5 '-utr הם שיתוף ביניהם לתוך תאים. (ב) Fluc mrna עם 5 '-פולי (A) מנהיג היה מקורה בתאים נגועים ו-vacv נגוע יחד עם Rluc mrna. 5 hpi, פעילות לוציפראז נמדד באמצעות לומימטר. Rluc פעילות Fluc מנורמל מיוצגת בתאים נגועים ו-VACV נגוע. קווי שגיאה מציינים את הסטיות הסטנדרטיות (SD) של לפחות שלוש חזרות. מבחן ה-t של הסטודנט שימש לקביעת ערכי P; . ערך פי < 0.001 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיבים | רצף |
| T7 יזם | מיכל הפקות |
| מנהיג פולי (A) | AAAAAAAAAAAA, החל מ 3 עד 51 כמו |
| סדרת קוזק | מג |
| הזנב פולי (A) | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
טבלה 1: רצפים המשמשים בשיטה – הטבלה מכילה את רצפי המקדם T7, פולי (א) מנהיג, סדרת קוזק, פולי (א) זנב.
| רכיבים | אמצעי אחסון |
| DNase מים חינם: | 38 מיקרומטר |
| 2X באיכות גבוהה DNA פולימראז מאסטר לערבב: | 50 מיקרומטר |
| פריימר קדימה (10 μM): | 4 מיקרומטר |
| פריימר הפוכה (10 μM): | 4 מיקרומטר |
| תבנית DNA לוציפראז (1-10 ng/μL): | 4 מיקרומטר |
| כולל | 100 מיקרומטר |
| מקור עבור Fluc תבנית DNA הוא pGL3-Fluc פלמיד | |
| מקור לתבנית ה-DNA של Rluc הוא pRL-Rluc פלמיד |
שולחן 2: תגובת ה-pcr – tהוא מזמין וכמות הרכיבים הנוספים בתגובת ה-pcr.
| צעד | טמפרטורה | זמן | חזור |
| דנטורציה ראשונית | 95 ° c | 2 דקות | (1x מחזור) |
| דנטורציה | 95 ° צ': | בנות 15 | |
| ריפוי | X ° צ': | שלושים בנות | (מחזור 25x) |
| סיומת | 72 ° צ': | טי מין | |
| הארכה סופית | 72 ° צ': | 7 דקות | (1x מחזור) |
| החזיק | 4 ° c: | ∞ |
שולחן 3: תוכנית ה-PCR-השלבים לתוכנית ה-PCR יחד עם טמפרטורה, זמן ומחזור.
| רכיבים | אמצעי אחסון | |
| DNase-RNase מים חינם: | עד 20 μL | |
| שילוב מאגר NTP (20 מ"מ של כל rNTP): | 2 מיקרומטר | |
| קאפ אנלוגי (40 מ"מ): | 4 מיקרומטר | |
| מוצר ה-PCR של התבנית (400 ng) *: | X μl | (PCR מוצר תלוי ריכוז) |
| T7-RNA פולימראז מערבבים: | 2 מיקרומטר | |
| כולל | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc ו T7_Kozak-Rluc תבנית משמש לסנתז 12A-Fluc ו-Kozak-Rluc mRNA, בהתאמה. |
שולחן 4: תגובת שעתוק מחוץ לגוף-הסדר וכמות הרכיבים הנוספים לתגובת שעתוק באמצעות מבחנה.
| צעדים | נפח/שעה |
| הכנס לוציפראאז שיטת התשתית (Fluc): | 30 μL |
| המתן/זמן דגירה: | מיכל השני |
| מדידה לומינסנציה (Fluc): | עשרה מנות |
| הפסק & גלו מצע (Rluc): | 30 μL |
| המתן/זמן דגירה: | מיכל השני |
| מדידה לומינסנציה (Rluc): | עשרה מנות |
טבלה 5: הגדרות מדידה לוציפראז – השלבים עבור מדידה לוציפראז עם הנפח או הזמן המומלצים.
| Primers | רצף |
| T7-12A-Fluc קדימה | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa מיכאל שגיא |
| T7-12A-Fluc הפוך | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACGGCGATCTTTCCGC |
| T7-קוזק-רולוק פורוורד | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc ליאת מיכאל |
| T7-קוזק-רלוק הפוך | לאחר מכן התגית ' לא ' מהווה GAGAACTCGCTC |
שולחן 6: התחל-היסוד המשמש בשיטה זו עם רצפים מלאים.
איור משלים 1: ניתוח נתונים גולמיים – שלבים לניתוח נתונים גולמיים כדי לקבל נתונים מנורמל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כל השלבים ארבע-ליבות הם קריטיים להצלחת המועתק מחוץ לחוק רנ א מבוסס RNA הכתב ללוציפראז. תשומת לב מיוחדת ניתנת לעיצוב פריימר, במיוחד עבור רצף היזם T7. T7 RNA פולימראז מתחיל תעתיק מן הראשון המסומן G (gGG-5'-UTR-AUG-) ב T7 יזם הוסיף לפני רצף 5 '-utr. למרות באתר להתחיל שעתוק (TSS) מתחיל מ-G הראשון בסוף 5 ', להקטין את מספר הפחות מ שלוש באזור T7 יזם ירד את התשואה RNA/פלט מ שעתוק מבחנה. במהלך הניסוי, הבחנו כי ג'ל מטוהרים DNA מוצר לא היה הטוב ביותר עבור שעתוק מבחנה כמו גם תשואה ואיכות של RNA היו נמוכים יותר. הרצנו רק 5-10% מתגובת ה-PCR ב-1% האגג ג'ל לקביעת הגודל וטיהרתי את השאר 90-95%, תוך שימוש בערכת טיהור ה-PCR, שישמשו לתמלול של מבחנה. במקרה של הגברה לא ספציפית מ-PCR, חיתוך להקה בגודל הרצוי מ-ג'ל ושימוש ברסיס DNA מטוהר ג'ל מומלץ. ככל שהתשואה עלולה להיות נמוכה, אנו מציעים להגדיל את נפח התגובה של תגובת שעתוק מבחנה. בדומה שיטות אחרות המבוססות על העברה, DNA/RNA עשוי לעורר DNA/RNA מסלולים חישה שעשויים באופן גלובלי או סלקטיבי לדכא תרגום. לכן יש לפרש נתונים בזהירות, למרות שלא הצלחנו לחוות בעיות שעלולות להיגרם כתוצאה מבעיה זו בניסויים שלנו.
השיטה המוצעת מתאימה לשימוש במערכות מודל שונות עם מספר שינויים כגון שיטת משלוח mRNA, שליטה פנימית לשימוש, זמן מתאים לתרגום, הכנה לדוגמה וניתוח של נתונים. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא כי היא שיטת עיתונאי לבדוק במהירות את רגולציה התרגום על ידי רכיבי חבר העמים כי אינם משקפים לחלוטין את התנאים הפיזיולוגיים. לכן יש לאשר שיטה זו על-ידי ניסויים משלימים אחרים, אם אפשר.
בהשוואה לשינוי ה-DNA, התפקידים של שינויי RNA פחות מובנים היטב. עם זאת, עם גילוי של אנזימים הכותבים, לקרוא ולמחוק שינויים RNA30,31,32,33,34,35, כעת ניתן ללמוד את ההשפעה של שינוי RNA ב-ביטוי גנטי30,31,32,33,34,35. בתוך החוץ מתורבת מבוסס RNA מבוססי הכתב לוציפראז עשוי להיות שונה כדי לשלב שינויים RNA שונים משמש כדי לבדוק את ההשפעות שלהם על ה-RNA תרגום. לדוגמה, שיטה זו יכולה לכלול כמוסות אנלוגיות שונות בעלי שינויים שונים30,31. בנוסף, להשלים RNA פנימי שינוי האנזים במהלך או אחרי שעתוק חוץ גופית יכול אולי לשלב שינוי RNA פנימי. תוספת של שינוי לאות 0, כובע 1, ו שינוי RNA פנימי יספק כלי כדי ללמוד את התפקידים של אלה שינויי RNA בתרגום.
בתוך מתורבת מבוסס RNA מבוססי הכתב ללוציפראז יש פוטנציאל גדול יישום נרחב בהבנת ביולוגיה בסיסית על ה-rna תרגום. מנגנונים שונים לייזום התרגום, כולל חניכה תלויי כובע, חניכה בלתי תלויה כובע, חניכה מחדש וחניכה פנימית כגון IRES ניתן ללמוד בשיטה זו. בנוסף ליתרונות אלה, ניתן ליישם בחינה זו כדי לבדוק את תקנה התרגום של רכיבי cisב-5 '-utr ו-3 '-utr ב-mrna. הפרוטוקול המתואר משתמש במוצר ה-PCR, המספק את היתרון כדי להימנע משכפול ארוך ולבחון במהירות את ההשפעות של רכיבי RNA בתרגום. כדי למזער את השגיאות הפוטנציאליות במהלך ה-PCR, יש להשתמש באמינות גבוהה פולימראז ובמספר נמוך של מחזור PCR. לחילופין, אם תבנית משמשת לעתים קרובות, הרצוי 5-' UTR ו-לוציפראז ORF ניתן לשכפל לתוך פלאמיד כתבנית של תמלול מחוץ למבחנה. יחד, הפרוטוקול מאחדת את התמלול ואת mrna בתגובה אחת ומנצל העברה קונבנציונאלי וניתוח שעושים באופן מתורבת מבוסס RNA כתב ללוציפראז שיטה ידידותית למשתמש, מהירה, וישירה לחקר מנגנונים של תרגום mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים רוצים לא להכריז על עניין פיננסי מתחרה.
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI128406 www.nih.gov) ל ZY ו בחלק על ידי מרכז המחקר של סרטן ג'ונסון (http://cancer.k-state.edu) בצורה של הסטודנט לתואר ראשון בקיץ לPD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
