Summary
Vi presenterer en protokoll for å studere mRNA oversettelse regulering i poxvirus celler med in vitro transkribere RNA-basert luciferase reporter analysen. Analysen kan brukes til å studere oversettelse regulering av CIS-elementer av en mRNA, inkludert 5 '-uoversatt region (UTR) og 3 '-UTR. Ulike oversettelse initiering moduser kan også undersøkes ved hjelp av denne metoden.
Abstract
Hver poxvirus mRNA skrives etter viral DNA-replikering har en evolutionarily bevart, ikke-mal 5 '-Poly (A) leder i 5 '-UTR. Å analysere rollen som 5 '-Poly (A) leder i mRNA oversettelse under poxvirus infeksjon vi utviklet en in vitro kopieres RNA-baserte luciferase reporter analysen. Denne reporteren analysen består av fire kjerne trinn: (1) PCR å forsterke DNA malen for in vitro transkripsjon; (2) in vitro transkripsjon å generere mRNA bruker T7 RNA polymerase; (3) transfeksjoner å innføre in vitro skrives mRNA inn i celler; (4) påvisning av luciferase aktivitet som indikator på oversettelsen. Den RNA-baserte luciferase reporter analysen beskrevet her omgår spørsmål om plasmider replikering i poxvirus-infiserte celler og kryptiske transkripsjon fra plasmider. Denne protokollen kan brukes til å bestemme oversettelse regulering av CIS-elementer i en mRNA inkludert 5 '-UTR og 3 '-UTR i andre systemer enn poxvirus-infiserte celler. Videre kan ulike moduser av oversettelsen innvielse som cap-avhengige, cap-uavhengig, re-innvielse, og intern innvielse bli undersøkt ved hjelp av denne metoden.
Introduction
Ifølge den sentrale dogme, genetisk informasjon flyter fra DNA til RNA og så til slutt til protein1,2. Denne flyten av genetisk informasjon er svært regulert på mange nivåer, inkludert mRNA Translation3,4. Utvikling av reporter analyser for å måle regulering av genuttrykk vil lette forståelsen av regulatoriske mekanismer som er involvert i denne prosessen. Her beskriver vi en protokoll for å studere mRNA oversettelse ved hjelp av en in vitro som kan skrives RNA-basert luciferase reporter analysen i poxvirus celler.
Poxviruses omfatter mange svært farlige mennesker og dyr patogener5. Som alle andre virus, poxviruses utelukkende stole på Host Cell maskiner for protein syntese6,7,8. For å effektivt syntetisere viral proteiner, utviklet virus mange strategier for å kapre Cellular translational maskiner for å omdirigere den for oversettelse av viral mRNAs7,8. En vanligvis ansatt mekanisme av virus er å bruke CIS-fungerende elementer i sine transkripsjoner. Bemerkelsesverdige eksempler inkluderer interne ribosom oppføring nettsted (IRES) og cap-Independent oversettelse Enhancer (Cite)9,10,11. Disse CIS-elementer gjengi viral transkripsjoner en translational fordel ved å tiltrekke translational maskiner via ulike mekanismer12,13,14. Over 100 poxvirus mRNAs har en evolutionarily bevart CIS-fungerende element i 5 '-uoversatt region (5 '-UTR): a 5 '-Poly (a) leder ved very 5 ' endene av disse mRNAs15,16. Lengdene av disse 5 '-Poly (A) lederne er heterogene og er generert av glidning av poxvirus-kodet RNA polymerase under transkripsjon17,18. Vi, og andre, nylig oppdaget at 5 '-Poly (A) leder gir en oversettelse fordel til en mRNA i celler infisert med vaccinia virus (VACV), prototypic medlem av poxviruses19,20.
In vitro transkribere RNA-baserte luciferase reporter analysen ble opprinnelig utviklet for å forstå rollen som 5 '-Poly (A) leder i mRNA oversettelse under poxvirus infeksjon19,21. Selv om plasmider DNA-baserte luciferase reporter analyser har vært mye brukt, er det flere ulemper som vil komplisere resultatet tolkning i poxvirus-infiserte celler. Først, plasmider er i stand til å gjenskape i VACV-infiserte celler22. Andre, kryptiske transkripsjon ofte oppstår fra plasmider DNA18,23,24. Tredje, VACV promoter-drevet transkripsjon genererer Poly (A)-leder av heterogene lengder følgelig gjør det vanskelig å kontrollere Poly (A)-leder lengde i noen eksperimenter18. En in vitro i RNA-baserte luciferase reporter-analysen omgår disse problemene og data tolkningen er grei.
Det er fire viktige trinn i denne metoden: (1) polymerase kjedere reaksjon (PCR) for å generere DNA-malen for in vitro-transkripsjon; (2) in vitro transkripsjon å generere mRNA; (3) transfeksjoner å levere mRNA inn i celler; og (4) påvisning av luciferase aktivitet som indikator på oversettelsen (figur 1). Den resulterende PCR-amplicon inneholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7-promoter, Poly (A) leder eller ønsket 5 '-UTR sekvens, Firefly luciferase åpen lese ramme (ORF) etterfulgt av en Poly (A) hale. PCR-amplicon brukes som mal for å syntetisere mRNA av in vitro-transkripsjon ved hjelp av T7-polymerase. Under in vitro transkripsjon, m7G cap eller andre cap analoge er innarbeidet i nylig syntetisert mRNA. Avkortet transkripsjoner er transfekterte inn infisert eller VACV-infiserte celler. Celle lysat samles i ønsket tid etter transfeksjoner for å måle luciferase aktiviteter som tyder på protein produksjon fra transfekterte mRNA. Dette reporter analysen kan brukes til å studere oversettelse regulering av CIS-element til stede i 5 '-UTR '-UTR eller andre regioner i en mRNA. Videre kan in vitro kopieres RNA-basert analysen brukes til å studere ulike mekanismer for oversettelse innvielse inkludert cap-avhengige initiering, cap-uavhengig innvielse, re-innvielse og intern innvielse som IRES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av DNA mal av PCR for in vitro transkripsjon
- For å forberede DNA malen ved PCR, design primere. Når designe primere vurdere avgjørende egenskaper som primer lengde, annealing temperatur (Tm), GC innhold, 3 ' ende med G eller C etc.
Merk: Diskutert i detalj i denne litteraturen25,26,27. - Design primere for å generere PCR-amplicon som inneholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7-promoter, Poly (A) leder, Firefly luciferase ORF og en Poly (A) hale referert heretter til som T7_12A-svingninger. Design primere (forover og bakover) for å omfatte alle de ekstra elementene som ikke finnes i malen DNA (figur 2a).
Merk: Sekvensen av alle elementer kan bli funnet i tabell 1. - Inkluder flere ekstra nukleotider i Forward primer (5 '-3 ')28, etterfulgt av T7-promoter, Poly (A) leder eller ønsket 5 '-UTR sekvens og ca 20 nukleotider, justere basert på Tm, tilsvarende til 5 ' slutten av reporteren genet ' s ORF. Sørg for at den tilsvarende regionen i primer er identisk med den fornemme tråden (+ strand) av genet.
Merk: For lange 5 '-UTR, syntetisere to DNA-fragmenter: en med T7 promoter etterfulgt av lange 5 '-UTR og andre med reporter genet ' s ORF. Bli med disse to fragmentene ved hjelp av overlappings forlengelse PCR29. - Design Reverse primer (5 '-3 ') for å inkludere Poly (A) hale og ca 20 nukleotider, justere basert på Tm, tilsvarende til 3 ' slutten av reporteren GENET er ORF. Sikre den tilsvarende regionen i primer er identisk med anti-Sense strand (-strand) av genet og en in-Frame stopp Codon er til stede før Poly (A) halen.
Merk: Ønsket lengde på A ' s i en Poly (A) leder eller Poly (A) halen kan tilpasses i primere. For eksempel, for å legge til 50 A står i Poly (A) halen, bør omvendt primer innebære 50 T's. På samme måte, for å legge til 20 A står i Poly (A) leder, bør frem primer innebære 20 A ' s. - For intern kontroll, designe et annet sett med primere som inneholder følgende elementer i 5 ' til 3 ' retning: T7 promoter, en tilfeldig 5 '-UTR koding sekvens som inneholder Kozak sekvens, Renilla luciferase ORF og Poly (a) hale referert heretter til som T7_ Kozak-Rluc.
- I et PCR-rør legger du til reagensene i følgende rekkefølge: DNase fritt vann, 2x High-Fidelity DNA polymerase, primere og sekvens bekreftet luciferase mal DNA (tabell 2).
Merk: Mengder av enkeltkomponenter i blandingen bør justeres i henhold til reaksjons volumet. - Bruk en standard 3-trinns (denaturering, annealing, Extension) PCR-syklus for å generere en DNA-mal som vist i tabell 3.
Merk: Annealing temperatur X ° c avhenger av primer settet som brukes og forlengelses tiden T min avhenger av PCR-amplicon størrelse og DNA-polymerase som brukes. - Oppdag PCR-produktet ved å kjøre 5-10% av PCR-reaksjonen i 1% agarose Tris-acetate-EDTA (TAE) gel-elektroforese (inneholdende 0,1 μg/ml etidiumbromid bromide) sammen med kommersielt tilgjengelig molekylvekt standard. Visualiser gelen under en UV-lampe for å bestemme størrelsen på PCR-produktet.
- Etter å bestemme riktig størrelse på PCR-produktet, ~ 1,7 kB for T7_12A-svingninger og ~ 1,0 kB for T7_Kozak-Rluc, rense den ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig PCR rensing kit. Eluere DNA ved hjelp 100 μL nuklease fritt vann (fig. 2b).
- Når renset, sjekk konsentrasjonen av DNA ved hjelp av en spektrofotometer og bestemme A260/A280 ratio (~ 1.8-2.0 er akseptabelt).
- Oppbevar renset DNA ved-20 ° c eller bruk for in vitro transkripsjon umiddelbart.
2. generere mRNA av in vitro transkripsjon
-
Syntetisere RNA fra PCR-produktet in vitro ved hjelp av en in vitro-transkripsjon Kit (figur 3a).
Merk: T7_12A-svingninger og T7_Kozak-RLUC DNA maler brukes til å syntetisere 12a-svingninger og Kozak-Rluc mRNAs, henholdsvis.- For å gjøre dette, ta en mikrosentrifugen tube og tilsett reagensene i følgende rekkefølge: DNase-RNase fritt vann, NTP buffer mix, cap analog, mal PCR produkt, T7-RNA polymerase mix (Tabell 4).
Merk: Andre capping systemer kan også brukes til å cap RNA sekvensielt etter in vitro transkripsjon følge produsentens instruksjon. - Bland godt og ruge ved 37 ° c for 2 t.
- Fortsett til rensing av syntetisert RNA ved hjelp av et RNA rensesett.
- For å gjøre dette, ta en mikrosentrifugen tube og tilsett reagensene i følgende rekkefølge: DNase-RNase fritt vann, NTP buffer mix, cap analog, mal PCR produkt, T7-RNA polymerase mix (Tabell 4).
- Kjør renset RNA i 1,5% agarose Tris-borate-EDTA (TBE) gel (som inneholder 0,5 μg/mL etidiumbromid bromide) for å kontrollere RNA. Visualiser gelen under en UV-lampe (figur 3b).
- Kontroller konsentrasjonen av RNA-en ved hjelp av en spektrofotometer og Bestem A260/A280-forholdet (~ 1.8-2.0 er akseptabelt).
- Alikvot den renset RNA og oppbevar ved-80 ° c.
3. Transfect mRNA til celler
- Seed HeLa celler i en 24-brønn plate (for å være ca. ~ 80-90% confluent neste dag) og ruge over natten i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2.
- Infisere HeLa celler med vaccinia virus (VACV) på et mangfold av smitte (MOI) av 5 eller holde infisert HeLa celler for sammenligning.
Merk: MOI er antall smittsomme viral partikler per celle. - MOI av X = {[(antall celler * X)/virus titer] * 1000} μL av virus per 1 mL medium.
-
Etter ønsket h post infeksjon (HPI) (i dette eksperimentet på 10-12 HPI), transfect mRNA (500 ng av totalt mRNA per brønn av 24-brønn plater) ved hjelp av en kationiske lipid transfeksjoner reagens som vist i figur 3c.
- For en brønn av en 24-brønn plate, bland 480 ng av 12A sekvens peiling Firefly luciferase (12A-svingninger) mRNA og 20 ng av Kozak sekvens peiling Renilla luciferase (Kozak-Rluc) mRNA i en mikrosentrifugen tube. I en annen mikrosentrifugen tube Tilsett 1,1 μL av kationiske lipid transfeksjoner reagens.
- Tilsett 55 μL av redusert serum medium i begge rørene. Bland og ruge ved romtemperatur i 5 min.
- Etter 5 min av inkubasjons, tilsett 55 μL kationiske lipid transfeksjoner reagens inneholdende redusert serum medium i mRNA inneholdende rør.
- Bland forsiktig, men grundig, og ruge ved romtemperatur i 15 min.
- Under inkubasjons, Fjern cellekultur mediet og tilsett 400 μL av redusert serum medium per brønn av 24-brønn plater.
- Etter inkubasjons, tilsett 100 μL av blandingen dråpevis og jevnt til en brønn av 24-brønn plater.
4. måle luciferase aktiviteter
- Fem timer etter transfeksjoner av 12A-svingninger og Kozak-Rluc mRNA, måle luciferase aktivitet ved hjelp av en luciferase analysen system i stand til å utføre to reporter analyser (f. eks dual luciferase reporter analysen Kit).
- Fjern det reduserte serum mediet og lyse cellene ved å tilsette 150 μL 1x lyseringsbuffer, en komponent i luciferase analysesett.
- Etter 10 min inkubasjons ved romtemperatur, samle lysat ved å kassering cellene og overføre til et mikrosentrifugen rør.
- Sentrifuger lysat ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c til pellets celle rusk.
- Tilsett 30 μL av supernatanten i 96 i ugjennomsiktig vegger og med en solid bunn.
- Mål den doble luminescence ved hjelp av luciferase analysesett og en multimode plate leser luminometeret.
- Utfør målingen ved hjelp av Kinetics funksjon (på en per-brønn-basis) ved hjelp av innstillingene beskrevet i tabell 5.
Merk: Lesingen kan også tas ved hjelp av manuell luminometeret. Legg til et lik volum av lysat og substrat for svingninger i en Cuvette. Vent 2 s og mål for 10 s ved hjelp av luminometeret. Etter svingninger måling, raskt ta ut Cuvette fra luminometeret og legge til et lik volum av underlaget for Rluc manuelt. Igjen, vent 2 s og måle for 10 s bruker luminometeret. - Eksporter luminescence som leser data til et ønskelig filformat.
- Bestem relativ omregnings rate fra 12A-svingninger mRNA i infisert og VACV infiserte HeLa celler ved å dele svingninger verdi av intern kontroll Rluc verdi.
Merk: Supplerende figur 1 viser trinnvis analyse av rådata for å få relativ svingninger aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fire trinnene av in vitro skrives RNA-basert luciferase reporter analysen: PCR å generere DNA mal for in vitro transkripsjon, in vitro transkripsjon å generere mRNA, mRNA transfeksjoner, og luciferase måling, kan sees i skjematisk diagram ( Figur 1). Design av primere for både DNA-maler (svingninger og Rluc) og den generelle ordningen med overheng forlengelse PCR er illustrert i skjematisk (figur 2a). Etter PCR ble PCR-produktet riktig størrelse oppdaget av TAE agarose gel elektroforese (figur 2b). Deretter brukes PCR-produktet som mal for å syntetisere RNA in vitro (figur 3a), som er renset og drevet i TBE gel-elektroforese for å verifisere størrelsen (figur 3b). Renset og verifisert mRNA er transfekterte i celler ved hjelp av kationiske lipid transfeksjoner reagens (figur 3c). Primere som brukes i denne protokollen, er listet opp i tabell 6.
The in vitro kopieres RNA-baserte luciferase reporter analysen ble utviklet for å forstå rollen som 5 '-Poly (A) leder i mRNA oversettelse under poxvirus infeksjon. Ved hjelp av denne analysen, testet vi oversettelsen effektiviteten av en svingninger mRNA som inneholder en 5 '-Poly (A) leder (12 NT) i infisert og VACV-infiserte celler. Den svingninger verdien ble normalisert bruker Rluc verdi i både infisert og VACV-infiserte celler for å bestemme den relative svingninger aktivitet (dvs. svingninger aktivitet/Rluc aktivitet) (figur 4a). Delingen av svingninger ved Rluc normalisert transfeksjoner effektivitet og RNA stabilitet i en bestemt brønn. Ved hjelp av denne analysen tilnærmingen, bestemte vi at en 5 '-Poly (A) leder som inneholder mRNA har en translational fordel under VACV infeksjon (figur 4b). Fordelen i infiserte celler var ikke på grunn av differensial transfeksjoner effektivitet eller mRNA stabilitet som RNA-nivået var lik i friske og VACV infiserte celler 5 h innlegg mRNA transfeksjoner19.
Figur 1: skjematisk av den eksperimentelle prosedyren. PCR brukes til å generere en DNA-mal med de ønskede elementene. mRNA koding et luciferase reporter gen er syntetisert in vitro ved hjelp av et T7 RNA polymerase-basert system. En Firefly luciferase (svingninger) mRNA er co-transfekterte med en Renilla luciferase (Rluc) mRNA inn infisert eller VACV-infiserte celler. Luciferase aktiviteter måles ved hjelp av en luminometeret med dobbel luciferase funksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: primer design og PCR-basert DNA forsterkning. (A) fremover primer er syntetisert for å inkludere en 8nt tilfeldig sekvens, T7 promoter etterfulgt av en ønsket 5 '-UTR og en del av 5 ' slutten av luciferase reporter genet, mens omvendt primer inneholder en T-skrift for å generere Poly (A) hale og 3 ' slutten av luciferase reporter genet. Ved overheng forlengelse PCR ved hjelp av en plasmider mal som inneholder et luciferase gen, genereres en DNA-mal. (B) DNA-bånd av ønsket størrelse fra PCR-reaksjonen ble oppdaget ved bruk av 1% agarose Tae gel elektroforese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mRNA syntese og transfeksjoner. (A) skjematisk av in vitro transkripsjon. DNA forsterket av PCR inneholder luciferase genet nedstrøms fra 5 '-UTR av interesse og T7 arrangøren brukes som mal. T7 RNA-polymerase er rekruttert til arrangøren og legger til ribonucleotid, vist i hvitt, fra 5 ' til 3 ' retning. Når mRNA er 25-30 NT lang, m7G cap er lagt til ved hjelp av en anti-revers cap analog, Arca. (B) RNA-bånd som ble oppdaget med 1,5% agarose TBE gel elektroforese. (C) skjematisk demonstrere transfeksjoner av reporter mRNA i celler. Medium som inneholder enten reporteren mRNA eller kationiske lipid transfeksjoner reagens i separate rør er lov til å likevekt ved romtemperatur i 5 min. Løsningene blandes deretter med inkubasjons ved romtemperatur i 15 minutter, hvoretter den RNA/transfeksjoner reagens blandingen legges til celler i kultur platene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: økt translational effektivitet av mRNA inneholder en 5 '-Poly (a) leder. (A) svingninger mRNA inneholder en Poly (a) leder i 5 '-UTR og Rluc MRNA med Kozak konsensus sekvensen i 5 '-UTR er co-transfekterte i celler. (B) svingninger mRNA med 5 '-Poly (A) leder ble transfekterte i infisert og VACV-infiserte celler sammen med Rluc mRNA. 5 HPI, luciferase aktivitet ble målt ved hjelp av en luminometeret. Rluc normalisert svingninger aktivitet er representert i infisert og VACV-infiserte celler. Feilfelt angir standardavvik (SD) på minst tre repetisjoner. Student t-test ble brukt til å bestemme P-verdier; P-verdi < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Elementer | Sekvens |
| T7 promoter | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Poly (A) leder | AAAAAAAAAAAA, alt fra 3 til 51 som |
| Kozak sekvens | GCCACC |
| Poly (A) hale | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
Tabell 1: sekvenser som brukes i metoden – tabellen inneholder sekvensene av T7 promoter, Poly (A) leder, Kozak sekvens, Poly (A) hale.
| Komponenter | Volum |
| DNase gratis vann: | 38 μL |
| 2X High-Fidelity DNA polymerase Master Mix: | 50 μL |
| Forward primer (10 μM): | 4 μL |
| Omvendt primer (10 μM): | 4 μL |
| Luciferase DNA-mal (1-10 ng/μL): | 4 μL |
| Totalt: | 100 μL |
| Kilde for svingninger DNA mal er pGL3-svingninger plasmider | |
| Kilde for Rluc DNA mal er pRL-Rluc plasmider |
Tabell 2: PCR-reaksjonen – than rekkefølge og volumet av komponenter lagt til i PCR-reaksjonen.
| Trinn | Temperatur | Tid | Syklus |
| Innledende denaturering | 95 ° c | 2 min | (1x syklus) |
| Denaturering | 95 ° c: | 15 s | |
| Annealing | X ° c: | 30 s | (25x syklus) |
| Forlengelsen | 72 ° c: | T min | |
| Endelig utvidelse | 72 ° c: | 7 min | (1x syklus) |
| Holde | 4 ° c: | ∞ |
Tabell 3: PCR-programmet – fremgangsmåten for PCR-programmet sammen med temperatur, tid og syklus.
| Komponenter | Volum | |
| DNase-RNase gratis vann: | opptil 20 μL | |
| NTP buffer mix (20 mM av hver rNTP): | 2 μL | |
| Cap analog (40 mM): | 4 μL | |
| Mal PCR produkt (400 ng) *: | X μL | (PCR-avhengig produkt konsentrasjon) |
| T7-RNA polymerase Mix: | 2 μL | |
| Totalt: | 20 μL | |
| * T7_12A-svingninger og T7_Kozak-Rluc mal brukes til å syntetisere 12A-svingninger og Kozak-Rluc mRNA, henholdsvis. |
Tabell 4: in vitro transkripsjon reaksjon-rekkefølgen og volumet av komponenter lagt for in vitro transkripsjon reaksjon.
| Trinn | Volum/tid |
| Injiser luciferase analyse substrat (svingninger): | 30 μL |
| Vent/inkubasjonstid: | 2 s |
| Luminescence måling (svingninger): | 10 s |
| Stopp & Glo substrat (Rluc): | 30 μL |
| Vent/inkubasjonstid: | 2 s |
| Luminescence måling (Rluc): | 10 s |
Tabell 5: luciferase målings innstillinger – trinnene for luciferase måling med anbefalt volum eller tid.
| Primere | Sekvens |
| T7-12A-svingninger forover | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG |
| T7-12A-svingninger omvendt | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACGGCGATCTTTCCGC |
| T7-Kozak-Rluc fremover | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc ATGACTTCGAAAGTTTATGATC |
| T7-Kozak-Rluc omvendt | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTGTTCATTTTT GAGAACTCGCTC |
Tabell 6: primere-den primere som brukes i denne metoden med komplette sekvenser.
Supplerende figur 1: analyse av rådata -trinn for å analysere rådata for å få normalisert data. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle fire-Core trinn er avgjørende for suksessen til in vitro kopieres RNA-basert luciferase reporter analysen. Spesiell oppmerksomhet bør gis til primer design, spesielt for T7 promoter sekvensen. T7 RNA polymerase starter transkripsjon fra den understrekede første G (GGG-5'-UTR-aug-) i T7 promoter lagt før 5 '-UTR sekvens. Selv om transkripsjon Start site (TSS) starter fra den første G på 5 ' end, redusere antall G er mindre enn tre i T7 promoter regionen redusert RNA yield/output fra in vitro transkripsjon. Under eksperimentet, observerte vi at gel renset DNA produktet var ikke den beste for in vitro transkripsjon som både yield og kvaliteten på RNA var lavere. Vi bare løp 5-10% av PCR reaksjonen i 1% agarose gel elektroforese å bestemme størrelsen og renset resten 90-95%, ved hjelp av en PCR rensing kit, som skal brukes til in vitro transkripsjon. Når det gjelder ikke-spesifikk forsterkning fra PCR, anbefales det å klippe det ønskede størrelse båndet fra gel og bruke gel-renset DNA-fragment. Som yield kan være lav, foreslår vi å øke reaksjons volumet for in vitro transkripsjon reaksjon. På samme måte som andre transfeksjoner-baserte metoder, kan DNA/RNA stimulere DNA/RNA-sensing som kan globalt eller selektivt undertrykke oversettelsen. Derfor bør data tolkes med forsiktighetsregler, selv om vi ikke opplevde problemer som potensielt skyldes dette problemet i eksperimentene våre.
Den foreslåtte metoden er egnet for bruk i ulike modellsystemer med noen modifikasjoner som metoden for mRNA levering, intern kontroll som skal brukes, en passende tid for oversettelse, prøve utarbeidelse og analyse av data. Den viktigste begrensningen av denne metoden er at det er en reporter analysen for raskt å teste oversettelse regulering av CIS elementer som ikke helt reflekterer fysiologiske forhold. Derfor bør denne metoden bli bekreftet av andre komplementære eksperimenter, hvis mulig.
Sammenlignet med DNA modifisering, rollene til RNA modifikasjoner er mindre godt forstått. Men med oppdagelsen av enzymer som skriver, lese og slette RNA modifikasjoner30,31,32,33,34,35, er det nå mulig å studere innflytelsen av RNA modifisering i genuttrykk30,31,32,33,34,35. Den in vitro i RNA-baserte luciferase reporter analysen kan endres til å innlemme ulike RNA modifikasjoner og brukes til å teste deres effekter på RNA oversettelse. Denne metoden kan for eksempel inkludere forskjellige cap-analogs som har ulike endringer30,31. I tillegg supplere en intern RNA modifisere enzym under eller etter in vitro transkripsjon kan muligens innlemme intern RNA modifikasjon. Tillegg av en modifikasjon til cap 0, cap 1, og en intern RNA modifikasjon vil gi et verktøy for å studere rollene til disse RNA modifikasjoner i oversettelsen.
Den in vitro i RNA-baserte luciferase reporter analysen har stort potensial og bred anvendelse i å forstå grunnleggende biologi om RNA oversettelse. Ulike mekanismer for initiering av oversettelsen, inkludert cap-avhengige initiering, cap-uavhengig innvielse, re-initiering og intern initiering som IRES kan bli studert ved hjelp av denne metoden. På toppen av disse fordelene, kan denne analysen være ansatt for å teste oversettelse regulering av CIS-elementer på 5 '-UTR og 3 '-UTR i en mRNA. Den beskrevne protokollen bruker PCR-produktet, som gir fordelen å unngå langvarig kloning og raskt undersøke virkningene av RNA elementer på oversettelsen. For å minimere potensielle feil under PCR, bør det brukes høykvalitets polymerase og lavt PCR syklus nummer. Alternativt, hvis en mal brukes hyppig, det ønsket 5-' UTR og luciferase ORF kan Klon i en plasmider idet malen av in vitro transkripsjon. Sammen, protokollen konsoliderer transkripsjon og mRNA capping i en enkelt reaksjon og benytter konvensjonelle transfeksjoner og analyse som gjør in vitro transkripsjon RNA-baserte luciferase reporter analysen en brukervennlig, rask og grei metode å studere mekanismer for mRNA oversettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ønsker å erklære ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) til ZY og delvis av Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) i form av graduate student Summer stipend til PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
