طريقه الربط المحسنة لايمونوبريسيبيتيشن (eCLIP) للتعرف الفعال علي الحمض الريبي المرتبط بالبروتين في خصيه الماوس
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول eCLIP لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي الرئيسية للمرشحين الملكي في الخصية.
Abstract
النطاف يحدد عمليه مرتبه للغاية من الذكور التمايز الخلايا الجرثومية في الثدييات. في الخصية ، والنسخ والترجمة غير مقترنة ، والتاكيد علي اهميه تنظيم ما بعد التحويل الجنسي للتعبير الجينات التي دبرها تقييديه. لتوضيح الأدوار الميكانيكية لل RBP ، يمكن استخدام منهجيه ايمونوبريسيبيتيشن (CLIP) للتقاط أهداف الجيش الملكي النيبالي المباشرة الذاتية وتحديد مواقع التفاعل الفعلية. المقطع المحسن (eCLIP) هو طريقه مطوره حديثا تقدم العديد من المزايا علي القصاصات التقليدية. ومع ذلك ، اقتصر استخدام eCLIP حتى الآن علي خطوط الخلايا ، داعيا إلى توسيع التطبيقات. هنا ، استخدمنا eCLIP لدراسة MOV10 و MOV10L1 ، اثنين من المعروفة الحمض الريبي النيبالي ملزمه الحلزونية ، في خصيه الماوس. كما هو متوقع ، ونحن نجد ان MOV10 في الغالب يربط إلى 3 ‘ المناطق غير المترجمة (UTRs) من mRNA و MOV10L1 يربط بشكل انتقائي إلى Piwi التفاعل الRNA (piRNA) السلائف المستنسخات. طريقه eCLIP الخاصة بنا تسمح بالتحديد السريع للأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبطة بمختلف تقييديه عن طريق التسلسل الصغير للمستنسخين التالي توفر المكتبات المؤهلة ، كامر قضائي للمضي في التسلسل العميق. وتحدد هذه الدراسة أساسا قابلا للتطبيق للحصول علي eCLIP في خصيه الثدييات.
Introduction
تمثل الخصية الثديية نموذجا تنمويا ممتازا حيث يعمل برنامج تمايز الخلايا المعقدة بشكل دوري لإنتاج العديد من النطاف. وتكمن القيمة الفريدة لهذا النموذج في ظهور التعطيل العابر للحدود في مراحل معينه من النطاف ، وعاده عندما يحدث التنشيط الكروموسوم الجنسي الذي يصيب الجنس الواحد (MSCI)1و2 وعند الخضوع لجولة نطفه الضغط النووي الشديد اثناء التسبب في النطاف3. وتستلزم هذه الاحداث العابرة المتعاقبة تنظيم الجينات بعد العجز ، الذي تلعب فيه البروتينات الملزمة بالحمض الريبي النيبالي (تقييديه) دورا حاسما ، وتشكل الناسخة وتحافظ علي خصوبة الذكور.
لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي حسن النية من الفرد في الجسم الطبيعي ، ووضعت الطريقة ايمونوبريسيبيتيشن (كليب)4،5، استنادا إلى ولكن ابعد من الجيش الملكي النيبالي العادي ايمونوبريسيبيتيشن (RIP)6،7 ، من خلال ادراج الخطوات الرئيسية بما في ذلك الاشعه فوق البنفسجية (UV) الربط ، وغسل صارمة ونقل هلام لتحسين خصوصية الاشاره. وقد اثار التطبيق المتقدم لل CLIP مع التسلسل عاليه الانتاجيه اهتماما كبيرا في التنميط البروتين-RNA التفاعل في مستويات الجينوم علي نطاق واسع8. بالاضافه إلى الدراسات الوراثية علي وظيفة الملكية الخاصة ، وكانت هذه الأساليب البيوكيميائية التي تحدد التفاعل المباشر للبروتين الذاتية والحمض الريبي النيبالي لا غني عنها لتوضيح بدقه الأدوار التنظيمية RNA من تقييديه. علي سبيل المثال ، MOV10L1 هو الخصية الحمض الريبي النيبالية الخاصة المطلوبة للخصوبة الذكور والحمض الريبي المتفاعل (piRNA) بيوجينيسيس9. ومن المعروف MOV10 paralogue التي أعرب عنها بشكل مطلق ومتعددة الوظائف الحمض الريبي النيبالي الحلزوني مع الأدوار في جوانب متعددة من البيولوجيا rna10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18. من خلال توظيف التقليدية كليب-seq ، وجدنا ان MOV10L1 يربط وينظم الاوليه pirna السلائف للبدء في وقت مبكر pirna معالجه19،20، وان MOV10 يربط mrna 3 ‘ utrs وكذلك الحمض الريبي النيبالي غير الترميز الأنواع في الخلايا الجرثومية الخصية (البيانات لم تظهر).
ومع ذلك ، CLIP هو في الأصل اجراء شاقه ، المشعة تليها اعداد مكتبه التسلسل مع خسارة ملحوظة من العلامات كليب. في مقطع التقليدية ، يتم اعداد مكتبه cDNA باستخدام محولات ligated في كل من الأطراف RNA. بعد هضم البروتين ، تظل الجزيئات القصيرة المتداخلة المتداخلة مرتبطة بشظايا الحمض الريبي النيبالي. هذه العلامة المتقاطعة كتل جزئيا النسخ العكسي (rtase) التقدم خلال التوليف cdna ، مما ادي إلى اقتطاع cdna التي تمثل حوالي 80 ٪ من مكتبه cdna21،22. التالي ، يتم تسلسل أجزاء cDNA الناتجة عن RTase تجاوز موقع الارتباط التشعبي (القراءة). في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت مختلف النهج كليب ، مثل PAR-كليب ، iclip ، eclip و uvclap ، لتحديد مواقع تشعبي من تقييديه في الخلايا الحية. PAR-كليب ينطوي علي تطبيق الاشعه فوق البنفسجية 365 nm والنظير النيوكليوتيد فوتواكتيكتابل التالي يقتصر علي الخلايا الحية في الذبح ، ودمج النظير النيونوسيد في المستنسخات التي تم توليفها حديثا عرضه لإنتاج التحيز حيث يتفاعل الجيش الريبي النيبالي جسديا مع البروتين23،24. في iCLIP ، يتم ربط محول واحد فقط إلى اقصي 3 ‘ من شظايا RNA المرتبطة. بعد النسخ العكسي (RT) ، يتم الحصول علي كل من المقتطعة والقراءة من خلال cdnas بواسطة إينتراموليكولارلي الدوران وأعاده الخطي تليها تفاعل البلمره سلسله (PCR) التضخيم25،26. ومع ذلك ، فان كفاءه الدوران داخل الجزيئات منخفضه نسبيا. علي الرغم من ان البروتوكولات القديمة كليب بحاجه إلى وضع العلامات من الحمض الريبي النيبالي مع النظائر المشعة ، الاشعه فوق البنفسجية والتقارب تنقيه (uvCLAP) ، مع عمليه تنقيه تقارب ترادفية صارمة ، لا تعتمد علي النشاط الإشعاعي27. ومع ذلك, uvCLAP يقتصر علي الخلايا المستزرعة التي يجب ان يتم نقلها مع ناقلات التعبير التي تحمل 3x العلم-HBH العلامة لتنقيه تقارب ترادفي.
في eCLIP ، كانت المحولات ligated الاولي في 3 ‘ اقصي من الجيش النيبالي الريبي تليها RT ، والمقبل في الطرف 3 ‘ من cDNAs في وضع بين الجزيئية. التالي ، eCLIP قادره علي التقاط جميع المقتطعة والقراءة من خلال cDNA28. كما انه لا يقتصر علي وضع العلامات المشعة ، ولا علي استخدام الخطوط الخلوية استنادا إلى مبداها ، مع الحفاظ علي قرار أحادي النوكليوتيد.
هنا ، ونحن نقدم وصفا خطوه بخطوه لبروتوكول eCLIP تكييفها لخصيه الماوس. لفتره وجيزة ، يبدا هذا البروتوكول eCLIP مع الاشعه فوق البنفسجية المتقاطعة من أنابيب الخصية ، تليها الهضم RNase الجزئي والايمونوبريسيبيتيشن باستخدام مضادات البروتين الخاصة. المقبل ، والحمض الريبي الذي يرتبط بالبروتين هو deفوسفوفورلات ، ومحول هو ligated إلى نهايته 3 ‘. بعد بروتين هلام الكهربائي والنقل من هلام إلى غشاء ، يتم عزل الحمض الريبي النيبالي عن طريق قطع منطقه الغشاء من نطاق الحجم المتوقع. بعد RT ، محول الحمض النووي هو ligated إلى نهاية 3 ‘ من cDNA تليها التضخيم PCR. ويتم فحص المستنسخات الفرعية قبل التسلسل العالي الانتاجيه كمراقبه لجوده المكتبة. هذا البروتوكول فعال في تحديد الأنواع الرئيسية من الحمض الريبي النيبالي المرتبط بالبروتين من تقييديه ، والتي تمثلها الخصيتين-التي تعبر عن الحمض الريبي النيبالي الحلزوني MOV10L1 و MOV10.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع زيادة فهم الدور العالمي لتقييديه تحت كل من السياقات البيولوجية والمرضية ، وقد استخدمت أساليب كليب علي نطاق واسع للكشف عن وظيفة الجزيئية من تقييديه20،32،33، 34,35. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تطبيقا م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر اريك L فان نوستراند وجين دبليو يو للتوجيه المفيد مع البروتوكول الأصلي. وقد تم دعم K.Z. من قبل برنامج المفتاح الوطني R & D من الصين (2016YFA0500902, 2018Yبرشلونه 1003500), والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771653). وقد دعمت L.Y. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81471502 ، 31871503) وبرنامج مبتكره وريادة الاعمال في مقاطعه جيانغسو.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania） |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
| Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
| Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
| Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
| Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
| Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
| TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Reagents | |||
| Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
| Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
| DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
| DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
| ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
| Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
| FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
| LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
| MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
| MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
| MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
| NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
| NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
| Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
| proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
| Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
| RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
| RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
| RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
| Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
| SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
| T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
| T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
| TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
| TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
| Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
| X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |
References
- Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
- Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
- Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
- Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
- Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
- Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
- Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).
- Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
- Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
- Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).
- Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).
- Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
- Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).
- Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
- Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
- Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
- Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
- Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).
