Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.
La spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l’importanza della regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell’RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l’uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3′ regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.
Il testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell’emergere dell’inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l’inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi3. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale, in cui le proteine leganti l’RNA (RBPs) svolgono un ruolo cruciale, modellando il trascrittoma e mantenendo la fertilità maschile.
Per identificare gli obiettivi di RNA in buona fede di un singolo RBP in vivo, è stato sviluppato il metodo reticolazione immunoprecipitazione (clip)4,5, basato ma oltre l’immunoprecipitazione dell’RNA regolare (RIP)6,7 , per incorporazione di passaggi chiave tra cui cross-linking ultravioletti (UV), lavaggio rigoroso e trasferimento di gel per migliorare la specificità del segnale. L’applicazione avanzata della CLIP combinata con il sequenziamento ad alto rendimento ha suscitato grande interesse nella profilazione dell’interazione proteina-RNA a livelli di genoma8. Oltre agli studi genetici sulla funzione RBP, tali metodi biochimici che identificano l’interazione diretta di proteina e RNA endogeni sono stati indispensabili per chiarire accuratamente i ruoli normativi dell’RNA nei RPB. Ad esempio, MOV10L1 è una elicasi di RNA specifica per i testicoli necessaria per la fertilità maschile e la biogenesi9dell’RNA che interagisce con PIWI (Pirna). Il suo paralogo MOV10 è conosciuto come un onnipresente e multifunzionale RNA elicasi con ruoli in molteplici aspetti della biologia dell’RNA10,11,12,13,14 , 15 anni di , 16 anni di , 17 anni di , 18. impiegando le clip-Seq convenzionali, abbiamo scoperto che MOV10L1 lega e regola i precursori Pirna primari per avviare l’elaborazione iniziale di Pirna19,20, e che MOV10 lega le UTR di mRNA 3′ e così come RNA non codificante specie nelle cellule germinate testicolari (dati non mostrati).
Tuttavia, CLIP è in origine una laboriosa, procedura radioattiva seguita da sequenza di preparazione della libreria con una notevole perdita di tag CLIP. Nella CLIP convenzionale, una libreria cDNA viene preparata utilizzando adattatori ligati ad entrambe le estremità dell’RNA. Dopo la digestione delle proteine, i polipeptidi corti reticolati restano attaccati ai frammenti di RNA. Questo segno di reticolazione blocca parzialmente la progressione della trascrittasi inversa (RTase) durante la sintesi di cDNA, risultando in cDNA troncati che rappresentano circa il 80% della libreria cDNA21,22. Pertanto, vengono sequenziati solo i frammenti cDNA risultanti da RTase che bypassano il sito di reticolazione (read-through). Recentemente, diversi approcci di CLIP, come PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, sono stati impiegati per identificare i siti Crosslink di RBPs nelle cellule viventi. PAR-CLIP prevede l’applicazione di 365 nm di radiazione UV e analoghi nucleotidici fotoattivabili ed è quindi esclusivo per le cellule viventi in-coltura, e l’incorporazione di analoghi nucleosidici in trascrizioni di nuova sintesi è incline a produrre pregiudizi dove RNA interagisce fisicamente con la proteina23,24. In iCLIP, solo un singolo adattatore è legato all’estremità 3′ di frammenti di RNA reticolati. Dopo la trascrizione inversa (RT), i cDNA troncati e read-through sono ottenuti mediante circolarizzazione intramoleularmente e re-linearizzazione seguita dall’amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)25,26. Tuttavia, l’efficienza della circolarizzazione intramolecolare è relativamente bassa. Sebbene i vecchi protocolli clip debbano etichettare l’RNA reticolato con un radioisotopo, il reticolazione ultravioletta e la purificazione dell’affinità (uvclap), con un processo di rigorosa purificazione dell’affinità di tandem, non si basano sulla radioattività27. Tuttavia, uvCLAP è limitato alle cellule coltivate che devono essere trasfected con il vettore di espressione portando il 3x FLAG-HBH tag per la purificazione di affinità tandem.
In eCLIP, gli adattatori sono stati legati prima all’estremità 3′ dell’RNA seguita da RT, e successivamente all’estremità 3′ dei cDNA in modalità intermolecolare. ECLIP è quindi in grado di catturare tutti i cDNA28troncati e read-through. Inoltre, non è limitato all’etichettatura radioattiva, né all’utilizzo di linee cellulari basate sul suo principio, pur mantenendo la risoluzione a singolo nucleotide.
Qui, forniamo una descrizione passo-passo di un protocollo eCLIP adattato per testis del mouse. Brevemente, questo protocollo eCLIP inizia con reticolazione UV dei tubuli testicolari, seguita da digestione parziale della RNAsi e immunoprecipitazioni utilizzando un anticorpo specifico per le proteine. Successivamente, l’RNA legato alla proteina è defosforilato e l’adattatore è legato alla sua estremità 3′. Dopo l’elettroforesi del gel proteico e il trasferimento da gel a membrana, l’RNA è isolato tagliando l’area della membrana di una gamma di dimensioni attese. Dopo RT, l’adattatore DNA è legato all’estremità 3′ del cDNA seguita dall’amplificazione della PCR. Lo screening dei subcloni prima del sequenziamento ad alto throughput è considerato un controllo di qualità della libreria. Questo protocollo è efficace nell’identificare le principali specie di RNA legato alle proteine di RBPs, esemplificato dai due RNA che esprimono i testicoli MOV10L1 e MOV10.
Con la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS20,32,33, 34,35. Il protocollo qui descritto rappresenta un’applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.
Una sfida ne…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Eric L Van Nostrand e gene W Yeo per una guida utile con il protocollo originale. K.Z. è stato supportato da National Key R & D programma della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31771653). L.Y. è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81471502, 31871503) e dal programma innovativo e imprenditoriale della provincia di Jiangsu.
Antibodies | |||
Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab(University of Pennsylvania) |
HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Reagents | |||
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |