Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Summary

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Abstract

La spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l’importanza della regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell’RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l’uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3′ regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.

Introduction

Il testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell’emergere dell’inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l’inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica^1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi³. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale, in cui le proteine leganti l’RNA (RBPs) svolgono un ruolo cruciale, modellando il trascrittoma e mantenendo la fertilità maschile.

Per identificare gli obiettivi di RNA in buona fede di un singolo RBP in vivo, è stato sviluppato il metodo reticolazione immunoprecipitazione (clip)^4,5, basato ma oltre l’immunoprecipitazione dell’RNA regolare (RIP)^6,7 , per incorporazione di passaggi chiave tra cui cross-linking ultravioletti (UV), lavaggio rigoroso e trasferimento di gel per migliorare la specificità del segnale. L’applicazione avanzata della CLIP combinata con il sequenziamento ad alto rendimento ha suscitato grande interesse nella profilazione dell’interazione proteina-RNA a livelli di genoma⁸. Oltre agli studi genetici sulla funzione RBP, tali metodi biochimici che identificano l’interazione diretta di proteina e RNA endogeni sono stati indispensabili per chiarire accuratamente i ruoli normativi dell’RNA nei RPB. Ad esempio, MOV10L1 è una elicasi di RNA specifica per i testicoli necessaria per la fertilità maschile e la biogenesi⁹dell’RNA che interagisce con PIWI (Pirna). Il suo paralogo MOV10 è conosciuto come un onnipresente e multifunzionale RNA elicasi con ruoli in molteplici aspetti della biologia dell’RNA^{10,11,12,13,14 , 15} anni di ^{, 16} anni di ^{, 17} anni di ^{, 18}. impiegando le clip-Seq convenzionali, abbiamo scoperto che MOV10L1 lega e regola i precursori Pirna primari per avviare l’elaborazione iniziale di Pirna^19,20, e che MOV10 lega le UTR di mRNA 3′ e così come RNA non codificante specie nelle cellule germinate testicolari (dati non mostrati).

Tuttavia, CLIP è in origine una laboriosa, procedura radioattiva seguita da sequenza di preparazione della libreria con una notevole perdita di tag CLIP. Nella CLIP convenzionale, una libreria cDNA viene preparata utilizzando adattatori ligati ad entrambe le estremità dell’RNA. Dopo la digestione delle proteine, i polipeptidi corti reticolati restano attaccati ai frammenti di RNA. Questo segno di reticolazione blocca parzialmente la progressione della trascrittasi inversa (RTase) durante la sintesi di cDNA, risultando in cDNA troncati che rappresentano circa il 80% della libreria cDNA^21,22. Pertanto, vengono sequenziati solo i frammenti cDNA risultanti da RTase che bypassano il sito di reticolazione (read-through). Recentemente, diversi approcci di CLIP, come PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, sono stati impiegati per identificare i siti Crosslink di RBPs nelle cellule viventi. PAR-CLIP prevede l’applicazione di 365 nm di radiazione UV e analoghi nucleotidici fotoattivabili ed è quindi esclusivo per le cellule viventi in-coltura, e l’incorporazione di analoghi nucleosidici in trascrizioni di nuova sintesi è incline a produrre pregiudizi dove RNA interagisce fisicamente con la proteina^23,24. In iCLIP, solo un singolo adattatore è legato all’estremità 3′ di frammenti di RNA reticolati. Dopo la trascrizione inversa (RT), i cDNA troncati e read-through sono ottenuti mediante circolarizzazione intramoleularmente e re-linearizzazione seguita dall’amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)^25,26. Tuttavia, l’efficienza della circolarizzazione intramolecolare è relativamente bassa. Sebbene i vecchi protocolli clip debbano etichettare l’RNA reticolato con un radioisotopo, il reticolazione ultravioletta e la purificazione dell’affinità (uvclap), con un processo di rigorosa purificazione dell’affinità di tandem, non si basano sulla radioattività²⁷. Tuttavia, uvCLAP è limitato alle cellule coltivate che devono essere trasfected con il vettore di espressione portando il 3x FLAG-HBH tag per la purificazione di affinità tandem.

In eCLIP, gli adattatori sono stati legati prima all’estremità 3′ dell’RNA seguita da RT, e successivamente all’estremità 3′ dei cDNA in modalità intermolecolare. ECLIP è quindi in grado di catturare tutti i cDNA²⁸troncati e read-through. Inoltre, non è limitato all’etichettatura radioattiva, né all’utilizzo di linee cellulari basate sul suo principio, pur mantenendo la risoluzione a singolo nucleotide.

Qui, forniamo una descrizione passo-passo di un protocollo eCLIP adattato per testis del mouse. Brevemente, questo protocollo eCLIP inizia con reticolazione UV dei tubuli testicolari, seguita da digestione parziale della RNAsi e immunoprecipitazioni utilizzando un anticorpo specifico per le proteine. Successivamente, l’RNA legato alla proteina è defosforilato e l’adattatore è legato alla sua estremità 3′. Dopo l’elettroforesi del gel proteico e il trasferimento da gel a membrana, l’RNA è isolato tagliando l’area della membrana di una gamma di dimensioni attese. Dopo RT, l’adattatore DNA è legato all’estremità 3′ del cDNA seguita dall’amplificazione della PCR. Lo screening dei subcloni prima del sequenziamento ad alto throughput è considerato un controllo di qualità della libreria. Questo protocollo è efficace nell’identificare le principali specie di RNA legato alle proteine di RBPs, esemplificato dai due RNA che esprimono i testicoli MOV10L1 e MOV10.

Protocol

Tutti gli esperimenti condotti sugli animali sono stati approvati dal comitato universitario di medicina di Nanjing. I topi maschi topi C57BL/6 sono stati mantenuti in condizioni di fotoperiodo controllato e sono stati forniti con cibo e acqua. 1. raccolta dei tessuti e crosslinking UV Euthanize 2 topi adulti che utilizzano anidride carbonica (CO2) per 1-2 min o fino a quando la respirazione si arresta. Successivamente, eseguire la dislocazione cervicale su ogni mouse.</li…

Representative Results

La procedura eclip e i risultati sono illustrati nella figura 1, figura 2, Figura 3, figura 4. I topi sono stati eutanizzati con anidride carbonica e una piccola incisione è stata fatta nel basso addome utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2a</st…

Discussion

Con la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS^{20,32,33, 34,35}. Il protocollo qui descritto rappresenta un’applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.

Una sfida ne…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876