Méthode améliorée d’Immunopréprécipitation de réticulation (eCLIP) pour l’identification efficace de l’ARN lié aux protéines dans les testicules de souris

Summary

Ici, nous présentons un protocole eCLIP pour déterminer les principales cibles d’ARN des candidats du RBP dans les testicules.

Abstract

La spermèse définit un processus hautement ordonné de différenciation des cellules germinales mâles chez les mammifères. Dans le testis, la transcription et la traduction sont découplées, soulignant l’importance de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique orchestrée par les RPB. Pour élucider les rôles mécanistes d’un RBP, la méthodologie d’immunopréprécipitation croisée (CLIP) peut être utilisée pour capturer ses cibles d’ARN directes endogènes et définir les sites d’interaction réels. Le CLIP amélioré (eCLIP) est une méthode nouvellement développée qui offre plusieurs avantages par rapport aux CLIPs conventionnels. Cependant, l’utilisation de eCLIP a jusqu’à présent été limitée aux lignées cellulaires, appelant à des applications élargies. Ici, nous avons employé eCLIP pour étudier MOV10 et MOV10L1, deux hélicases connues de liaison d’ARN, dans des testicules de souris. Comme prévu, nous constatons que MOV10 se lie principalement à 3 ‘régions non traduites (UTRs) de mRNA et MOV10L1 se lie sélectivement aux transcriptions des précurseurs de l’ARN en interaction piwi (piRNA). Notre méthode eCLIP permet la détermination rapide des principales espèces d’ARN liées par divers RPB par le séquençage à petite échelle des sous-clones et donc la disponibilité des bibliothèques qualifiées, comme un mandat pour procéder à un séquençage profond. Cette étude établit une base applicable pour eCLIP dans les testicules des mammifères.

Introduction

Le testicules de mammifères représente un excellent modèle de développement dans lequel un programme complexe de différenciation cellulaire s’exécute cycliquement pour produire de nombreux spermatozoïdes. Une valeur unique de ce modèle réside dans l’émergence de l’inactivation transcriptionnelle à certains stades de la spermèse, typiquement lorsque l’inactivation des chromosomes sexuels méiotiques (MSCI) se produit^1,2 et lorsque les spermatides ronds subissent compactage nucléaire drastique pendant la spermiogenèse³. Ces événements transcriptionnels inconsécutifs nécessitent une régulation génique post-transcriptionnelle, dans laquelle les protéines liant l’ARN (RPB) jouent un rôle crucial, formant le transcriptome et conservant la fertilité masculine.

Pour identifier les cibles d’ARN de bonne foi d’un RBP individuel in vivo, la méthode de réticulation par immunoprécipitation (clip) a été développée^4,5, basée sur mais au-delà de l’immunopreprécipitation à l’ARN ordinaire (RIP)^6,7 , par incorporation d’étapes clés, y compris la réticulation ultraviolette (UV), un transfert de gel et de lavage rigoureux pour améliorer la spécificité du signal. L’application avancée du CLIP combinée à un séquençage à haut débit a suscité un grand intérêt pour le profilage de l’interaction protéine-ARN aux niveaux⁸de l’ensemble du génome. En plus des études génétiques sur la fonction RBP, ces méthodes biochimiques qui identifient l’interaction directe de la protéine endogène et de l’ARN ont été indispensables pour élucider avec précision les rôles de régulation de l’ARN des RPB. Par exemple, MOV10L1 est une hélicase d’ARN spécifique aux testicules requise pour la fertilité masculine et la biogenèse⁹de l’ARN en interaction piwi (Pirna). Son paralogue MOV10 est connu comme une hélicase d’ARN façon ubiquitaire exprimée et multifonctionnelle avec des rôles dans de multiples aspects de la biologie de l’ARN^{10,11,12,13,14 ,} le ^{15 ,} le ^{16 ,} le ^{17 , 18}. en employant le clip-SEQ conventionnel, nous avons constaté que MOV10L1 lie et régule les précurseurs de Pirna primaires pour initier le traitement de Pirna précoce^19,20, et que MOV10 lie mRNA 3 ‘utrs et aussi bien que l’ARN de non codantes cellules germinales testiculaires (données non illustrées).

Néanmoins, CLIP est à l’origine une procédure laborieuse et radioactive suivie par la préparation de la bibliothèque de séquençage avec une perte remarquable de balises CLIP. Dans le CLIP conventionnel, une bibliothèque d’ADNc est préparée à l’aide d’adaptateurs ligés aux deux extrémités de l’ARN. Après la digestion des protéines, les polypeptides courts réticulé demeurent attachés à des fragments d’ARN. Cette marque de réticulation bloque partiellement la progression de la transcriptase inverse (RTase) pendant la synthèse de l’ADNc, ce qui entraîne des cDNAs tronqués qui représentent environ 80% de la bibliothèque de l’ADNc^21,22. Ainsi, seuls les fragments d’ADNc résultant de RTase contournant le site de réticulation (lecture-à travers) sont séquencés. Récemment, diverses approches de CLIP, telles que PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP et uvCLAP, ont été employées pour identifier les sites de Crosslink des RBPs dans les cellules vivantes. PAR-CLIP implique l’application de 365 nm de rayonnement UV et d’analogues de nucléotides photoactivables et est donc exclusif à la culture des cellules vivantes, et l’incorporation d’analogues nucléosidiques dans les transcriptions nouvellement synthétisées est sujette à la production de biais où l’ARN interagit physiquement avec la protéine^23,24. Dans iCLIP, un seul adaptateur est ligné à l’extrémité 3 ‘des fragments d’ARN réticulés. Après la transcription inversée (RT), les cDNAs tronqués et lus-through sont obtenus par circularisation intramoléculaire et relinéarisation, puis par amplification de la polymérase en chaîne (PCR)^25,26. Cependant, l’efficacité de la circularisation intramoléculaire est relativement faible. Bien que les protocoles CLIP plus anciens ont besoin d’étiquetage de l’ARN réticulé avec un radio-isotopes, la réticulation ultraviolette et la purification d’affinité (uvCLAP), avec un processus de purification d’affinité tandem stricte, ne repose pas sur la radioactivité²⁷. Néanmoins, uvCLAP est limitée aux cellules cultivées qui doivent être transftées avec le vecteur d’expression portant la balise 3x FLAG-HBH pour la purification d’affinité en tandem.

Dans eCLIP, les adaptateurs ont été lignés d’abord à l’extrémité 3 ‘de l’ARN suivie de RT, et ensuite à l’extrémité 3 ‘des cDNAs en mode intermoléculaire. Par conséquent, eCLIP peut capturer tous les cDNA²⁸tronqués et lus. En outre, il n’est ni limité à l’étiquetage radioactif, ni à l’utilisation de lignées cellulaires en fonction de son principe, tout en conservant une résolution mono-nucléotide.

Ici, nous fournissons une description étape par étape d’un protocole eCLIP adapté pour les testicules de souris. Brièvement, ce protocole eCLIP commence par une réticulation UV des tubules testiculaires, suivie d’une digestion partielle de la RNase et d’une immunopréprécipitation à l’aide d’un anticorps spécifique aux protéines. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylé, et l’adaptateur est ligné à son extrémité 3 ‘. Après l’électrophorèse sur gel protéique et le transfert gel-membrane, l’ARN est isolé en coupant la zone membranaire d’une fourchette de taille attendue. Après RT, l’adaptateur d’ADN est ligné à l’extrémité 3 ‘de l’ADNc suivi de l’amplification par PCR. Le filtrage des sous-clones avant le séquençage à haut débit est considéré comme un contrôle de qualité de bibliothèque. Ce protocole est efficace pour identifier les principales espèces d’ARN lié aux protéines des RPB, illustré par les deux hélicases d’ARN exprimant le testif MOV10L1 et MOV10.

Protocol

Toutes les expérimentations animales réalisées ont été approuvées par le Comité de l’Université médicale de Nanjing. Les souris mâles C57BL/6 ont été maintenues dans des conditions de photopériode contrôlées et ont été livrées avec de la nourriture et de l’eau. 1. récolte de tissus et réticulation UV Euthanasier 2 souris adultes à l’aide de dioxyde de carbone (CO2) pendant 1-2 min ou jusqu’à ce que la respiration s’arrête. Ensuite, effectue…

Representative Results

La procédure et les résultats de l’eclip sont illustrés à la figure 1, figure 2, figure 3, figure 4. Les souris ont été euthanasiées avec du dioxyde de carbone et une petite incision a été faite dans le bas-ventre à l’aide de ciseaux chirurgicaux (<strong c…

Discussion

Avec une meilleure compréhension du rôle universel des RPB dans les contextes biologiques et pathologiques, les méthodes d’agrafe ont été largement utilisées pour révéler la fonction moléculaire du rbps^{20,32,33, 34,35}. Le protocole décrit ici représente une application adaptée de la méthode eCLIP à la souris testis.

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Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876