Улучшенный перекрестное связывание иммунология (eCLIP) метод эффективной идентификации белка связаны РНК в яичной яичка
Summary
Здесь мы представляем протокол eCLIP, чтобы определить основные цели РНК кандидатов RBP в яички.
Abstract
Сперматозогенез определяет весьма упорядо, процесс дифференциации мужских половых клеток у млекопитающих. В семенных цех транскрипция и перевод являются несопряжениями, подчеркивая важность посттранскрипционного регулирования экспрессии генов, организованного РБП. Чтобы разъяснить механистические роли RBP, перекрестно-связывающая иммунологическая (клип) методология может быть использована для захвата его эндогенных прямых целей РНК и определить фактические сайты взаимодействия. Улучшенный клип (eCLIP) является недавно разработанный метод, который предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными клипы. Тем не менее, использование eCLIP до сих пор ограничивается клеточных линий, призывая к расширению приложений. Здесь мы использовали eCLIP для изучения MOV10 и MOV10L1, двух известных РНК-связывающих гелиаз, в яичной мышке. Как и ожидалось, мы находим, что MOV10 в основном связывается с 3 ‘ непереведенные регионы () мРНК и MOV10L1 выборочно связывается с Пиви-взаимодействующие РНК (piRNA) прекурсоров стенограммы. Наш метод eCLIP позволяет быстро определять основные виды РНК, связанные различными РБП, посредством мелкомасштабной последовательности подклонов и, таким образом, наличия квалифицированных библиотек в качестве ордера для продолжения глубокой секвенирования. Это исследование устанавливает применимое основание для eCLIP в млекопитающих Семенов.
Introduction
Млекопитающего семенника представляет собой отличную модель развития которой сложная программа дифференциации ячейки проходит циклически приносить многочисленные сперматозомы. Уникальное значение этой модели заключается в появлении транскрипционной инактивации на определенных этапах сперматозоиды, как правило, при инактивирования половых хромосом (MSCI), возникающее1,2 и когда круглые сперматиды подвергаются резкое ядерное уплотнение во время спермиогенеза3. Эти непоследовательные транскрипционные события обусловливают необходимость посттранскрипционного гена, в котором РНК-связывающие белки (РБП) играют решающую роль, формируя транскриптом и поддерживая мужскую фертильность.
Для выявления добросовестных целей РНК отдельных РБП в естественных условиях, перекрестные иммунорецидивицион (клип) метод был разработан4,5, на основе, но за пределами регулярных РНК иммуноопципиции (RIP)6,7 , путем включения ключевых шагов, включая ультрафиолетовые (УФ) перекрестки, строгие мытье и гель передачи для улучшения специфики сигнала. Современное применение КЛИПА в сочетании с высокой пропускной способностью секвенирования вызвало большой интерес к профилированию белка-РНК взаимодействия на уровне генома8. В дополнение к генетическим исследованиям по функции RBP, такие биохимические методы, которые определяют прямое взаимодействие эндогенного белка и РНК, были незаменимы для точного прояснению регуляторных ролей РБП. Например, MOV10L1 является семенным специфические РНК гелиазы, необходимые для мужской плодовитости и Пиви-взаимодействующие РНК (piRNA) биогенеза9. Его MOV10 известен как повсеместно выраженный и многофункциональный РНК гелиаза с ролями в нескольких аспектах РНК биологии10,11,12,13,14 , 15 , в 16 лет , 17 , 18. путем использования обычного клипа-Seq, мы обнаружили, что MOV10L1 связывает и регулирует первичные прекурсоров Pirna инициировать раннее Pirna обработки19,20, и что MOV10 связывает мРНК 3 ‘ и, а также некодирующих РНК видов в зародышевых клетках яичка (данные не показаны).
Тем не менее, клип первоначально трудоемкий, радиоактивные процедуры следуют последовательности подготовки библиотеки с замечательной потерей Теги клип. В обычном клипе, Библиотека cDNA готовится с помощью адаптеров, лигирован на обеих РНК конечностей. После переваривания белка, пересекаемый короткие полипептиды остаются прикрепленными к фрагментам РНК. Это связывание Марк частично блокирует обратную транскриптазы (ритазы) прогрессии во время синтеза кДНК, в результате чего усеченные кдснк, которые составляют около 80% от cDNA библиотека21,22. Таким образом, только фрагменты кДНК, возникающие в результате Ритазы, минуя узел связывания (прочитаны), упорядочены. В последнее время различные подходы клип, такие как пар-клип, Icлипа, Ecлипа и УВВ, были использованы для выявления перекрестных сайтов РБП в живых клетках. ПАР-клип включает в себя применение 365 Нм УФ-излучения и фотоактизационные нуклеотидных аналогов и, следовательно, исключительно в-культивирования живых клеток, и включение аналогов нуклеозидов в недавно синтезированных стенограммы склонен к производству смещения где РНК физически взаимодействует с белком23,24. В iclip, только один адаптер лигирован 3 ‘ оконечности пересекаемыми РНК фрагментов. После обратной транскрипции (RT), как укороченные, так и просчитаны, получаются интрааминомолекулинно-циркуляризация и реполяризации, сопровождаемая полимеразной цепной реакцией (КЦР) усиление25,26. Однако эффективность внутримолекулярной циркуляризации относительно низка. Хотя более старые протоколы КЛИПА нуждаются в маркировке пересекающей РНК с радиоизотопом, ультрафиолетовым перекрестком и очищением сродства (УВВ), с процессом очищения сродства тандем, не полагается на радиоактивность27. Тем не менее, уввх ограничивается культивируемых клеток, которые должны быть преобразовано с вектором выражения, перевозящих 3x флаг-тег ХБГ для тандем очистки сродства.
В eclip, адаптеры были лигирован сначала на 3 ‘ оконечности РНК следуют RT, а затем на 3 ‘ оконечности ДКД в межмолекулярном режиме. Таким образом, eCLIP может захватить все усеченные и прочитаны cDNA28. Кроме того, он не ограничен ни радиоактивными маркировкой, ни использованием клеточных линий, основанных на его принципе, сохраняя при этом однонуклеотидное разрешение.
Здесь мы предоставляем пошаговое описание протокола eCLIP, адаптированного для яички мыши. Кратко, этот протокол eCLIP начинается с УФ-скрещивания тестикулярных канальцев, а затем частичное пищеварение Нрсэ и иммунорецепции с использованием белка-специфического антитела. Далее, связанная с белками РНК является дефосфорилированной, и адаптер линируется к его концу 3. После белка гель электрофорез и гель-мембраны передачи, РНК изолирована путем разрезания мембраны области ожидаемого размера диапазона. После RT, ДНК адаптер лигирован в 3 ‘ конец cDNA с последующим усилением поцр. Скрининг подклонов до последовательности высокой пропускной способности принимается как контроль качества библиотеки. Этот протокол эффективен при выявлении основных видов белок-привязных РНК РБП, примером которых являются два семенного выражения РНК гелиаз MOV10L1 и MOV10.
Protocol
Representative Results
Discussion
С увеличением понимания универсальной роли одпс как в биологическом, так и в патологическом контекстах, методы клипа широко использовались для выявления молекулярной функции РБП20,32,33, 34,35. Описанн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Эрика л Ван Ностранд и Джин в ё за полезное руководство с исходным протоколом. К.З. был поддержан национальной ключевой R & D программа Китая (2016YFA0500902, 1003500), и Национальный фонд естественных наук Китая (31771653). Л.И. была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81471502, 31871503) и инновационной и предпринимательской программой провинции Цзянсу.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania） |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
| Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
| Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
| Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
| Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
| Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
| TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Reagents | |||
| Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
| Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
| DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
| DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
| ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
| Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
| FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
| LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
| MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
| MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
| MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
| NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
| NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
| Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
| proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
| Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
| RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
| RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
| RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
| Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
| SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
| T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
| T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
| TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
| TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
| Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
| X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |
References
- Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
- Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
- Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
- Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
- Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
- Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
- Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).
- Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
- Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
- Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).
- Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).
- Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
- Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).
- Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
- Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
- Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
- Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
- Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).
