Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis

Summary

Hier stellen wir ein eCLIP-Protokoll vor, um die wichtigsten RNA-Ziele von RBP-Kandidaten in Hoden zu ermitteln.

Abstract

Die Spermatogenese definiert einen sehr geordneten Prozess der männlichen Keimzelldifferenzierung bei Säugetieren. In den meisten Hoden werden Transkriptionen und Übersetzungen entkoppelt, was die Bedeutung der nachträglichen Regulierung der von RBPs orchestrierten Genexpression unterstreicht. Um die mechanistische Rolle eines RBP zu erklären, kann die Vernetzung der Immunop-(CLIP)-Methodik verwendet werden, um die endogenen direkten RNA-Ziele zu erfassen und die tatsächlichen Interaktionsorte zu definieren. Das erweiterte CLIP (eCLIP) ist ein neu entwickeltes Verfahren, das gegenüber den herkömmlichen CLIPs mehrere Vorteile bietet. Allerdings ist die Nutzung von eCLIP bisher auf Zelllinien beschränkt, was erweiterte Anwendungen fordert. Hier haben wir eCLIP eingesetzt, um MOV10 und MOV10L1, zwei bekannte RNA-bindende Helicases, in Mäusehden zu studieren. Wie zu erwarten, stellen wir fest, dass MOV10 überwiegend an 3 ‘ nicht übersetzte Regionen (UTRs) von mRNA und MOV10L1 selektiv an Piwi-interagierende RNA (piRNA) Vorläuferprotokolle bindet. Unsere eCLIP-Methode ermöglicht die schnelle Bestimmung von großen RNA-Arten, die durch verschiedene RBPs durch kleine Sequenzierung von Subklonen und damit die Verfügbarkeit von qualifizierten Bibliotheken gebunden sind, als Garantie für die Durchführung einer tiefen Sequenzierung. Diese Studie schafft eine anwendbare Grundlage für eCLIP in Säugetierhauszeugen.

Introduction

Mammalian testis stellt ein hervorragendes Entwicklungsmodell dar, bei dem ein kompliziertes Zelldifferenzierungsprogramm zyklisch läuft, um zahlreiche Spermien zu erzeugen. Ein einzigartiger Wert dieses Modells liegt in der Entstehung der transkriptionalen Inaktivierung in bestimmten Stadien der Spermatogenese, typischerweise wenn die meiotische Geschlechtchromosome-Inaktivierung (MSCI) 1^{, 2 auftritt} und wenn runde Spermien sich unterziehen. Drastische nukleare Verdichtung^währendder Spermiogenese 3. Diese inkonsekutiven transkriptionalen Ereignisse erfordern eine posttranskriptionale Genregulation, bei der RNA-bindende Proteine (RBPs) eine entscheidende Rolle spielen, die Transkriptome prägen und die männliche Fruchtbarkeit erhalten.

Um die echten RNA-Ziele eines einzelnen RBP in vivo zu identifizieren, wurde die vernetzte Immunop-(CLIP) Methode mit 4,5 entwickelt, basierendauf dem regulären RNA-Immunsystem (RIP)^6,7 , durch die Einfügung von Schlüsselschritten, einschließlich der ultravioletten (UV) Vernetzung, strenger Wasch-und Gelübertragung, um die Signalspezifik zu verbessern. Die fortschrittliche Anwendung des CLIP in Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung hat großes Interesse an der Profi-Protein-RNA-Interaktion auf genomweiten Ebenen⁸geweckt. Zusätzlich zu genetischen Studien zur RBP-Funktion waren solche biochemischen Methoden, die das direkte Zusammenspiel von endogenem Protein und RNA identifizieren, unverzichtbar, um die RNA-regulatorische Rolle von RBPs genau zu erklären. MOV10L1 ist zum Beispiel eine weitenspezifische RNA-Helicase, die für die männliche Fruchtbarkeit und die Piwi-interagierende RNA (piRNA) Biogenese 9 benötigt wird. Sein paralogue MOV10 ist bekannt als allgegenwärtig ausgedrückte und multifunktionale RNA-Helicase^mitRollen in verschiedenen Aspekten der RNA-Biologie 10^{,11, 12,13 ,}14 ^{, 15 , 16 , 17 , 18}. Durch den Einsatz der herkömmlichen CLIP-seq, fanden wir, dass MOV10L1 bindet und reguliert primäre PiRNA-Vorläufer, um frühe piRNA-Verarbeitung^19,20zu initiieren, und dass MOV10 mRNA 3 ‘ UTRs und sowie nicht-coding RNA Arten in Hodenkeimzellen (Daten nicht abgebildet).

Dennoch ist CLIP ursprünglich ein mühsames, radioaktives Verfahren, gefolgt von der Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung mit einem bemerkenswerten Verlust von CLIP-Tags. In der herkömmlichen CLIP wird eine cDNA-Bibliothek mit Adaptern vorbereitet, die an beiden RNA-Extremitäten ligiert sind. Nach der Proteinverdauung bleiben vernetzte kurze Polypeptide an RNA-Fragmenten befestigt. Diese Vernetzungsmarke blockiert die Reverse Transkriptase (RTase) während der cDNA-Synthese teilweise, was zu verkürzten cDNAs führt, die etwa 80%der cDNA-Bibliothek^21,22ausmachen. So werden nur cDNA-Fragmente sequenziert, die aus RTase resultieren, die die Vernetzungsstelle umgehen (Durchlesen). In jüngster Zeit wurden verschiedene CLIP-Ansätze wie PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP und uvCLAP eingesetzt, um Querlink-Standorte von RBPs in lebenden Zellen zu identifizieren. PAR-CLIP beinhaltet die Anwendung von 365 nm UV-Strahlung und photoaktivierbaren Nukleotid-Analogen und ist daher ausschließlich für die In-kulturierende lebende Zellen, und die Einbindung von Nukleosid-Analogen in neu synthetisierte Transkripte ist anfällig für die Produktion von Bias Dort, wo die RNA physischmit dem Protein 23^,24interagiert. In iCLIP wird nur ein einziger Adapter an die 3 ‘ Extremität der vernetzten RNA-Fragmente gekoppelt. Nach der umgekehrten Transkription (RT) werden sowohl verkürzte als auch durchlässige cDNAs durch intramolekulare Zirkularisierung und Re-Linearisierung erreicht, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 25^,26verstärkt. Die Effizienz der intramolekularen Kreislaufisierung ist jedoch relativ gering. Obwohl ältere CLIP-Protokolle eine Kennzeichnung der vernetzten RNA mit einem Radioisotop benötigen, setzt die ultraviolette Vernetzung und Affinitätsreinigung (uvCLAP) bei einem Prozess der strengen Tandemaffinitätsreinigung nicht auf Radioaktivität 27. Dennoch beschränkt sich uvCLAP auf kultivierte Zellen, die mit dem Expressionsvektor, der das 3x FLAG-HBH-Tag zur Tandemaffinitätsreinigung trägt, transferiert werden müssen.

In eCLIP wurden Adapter zuerst an der 3 ‘ Extremität der RNA, gefolgt von RT, und als nächstes an der 3 ‘ Extremität von cDNAs in einem intermolekularen Modus. Damit ist eCLIP in der Lage, alle abgeschnittenen und durchlasen cDNA²⁸zu erfassen. Außerdem beschränkt sie sich weder auf die radioaktive Kennzeichnung, noch auf die Verwendung von Zelllinien nach ihrem Prinzip, während die Auflösung von Nukleotiden beibehalten wird.

Hier finden Sie eine schrittweise Beschreibung eines eCLIP-Protokolls, das für den Mäusehausamser angepasst ist. Kurz gesagt, dieses eCLIP-Protokoll beginnt mit der UV-Vernetzung von Hodenröhrungen, gefolgt von einer teilweisen RNase-Verdauung und Immuntherapie mit einem proteinspezifischen Antikörper. Als nächstes wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert, und der Adapter wird bis zu seinem 3 ‘ Ende ligiert. Nach der Protein-Gel-Elektrophorese und der Gel-zu-Membran-Übertragung wird die RNA durch das Schneiden der Membranfläche eines erwarteten Größenbereiches isoliert. Nach RT wird der DNA-Adapter an das 3 ‘ Ende der cDNA ligiert, gefolgt von PCR-Verstärkung. Das Screening von Subklonen vor der Hochdurchsatz-Sequenzierung wird als Qualitätskontrolle der Bibliothek genommen. Dieses Protokoll ist effizient bei der Identifizierung der wichtigsten Arten von proteingebundenen RNA von RBPs, beispielhaft für die beiden Protden-Ausdruck RNA-Helikasen MOV10L1 und MOV10.

Protocol

Alle durchgeführten Tierversuche wurden vom Ausschuss der Nanjing Medical University genehmigt. Männliche C57BL/6 Mäuse wurden unter kontrollierten Photoperiodenbedingungen gehalten und mit Nahrung und Wasser versorgt. 1. Gewebeernte und UV-Kreuzung 2 erwachsene Mäuse mit Kohlendioxid (CO2) für 1-2 Minuten oder bis die Atmung anhält, mit Sterbezeit beweiden. Als Nächstes führen Sie die Gebärmutterhalskrebs auf jeder Maus durch. Ernten Sie für jedes Immu…

Representative Results

Das eCLIP-Verfahren und die Ergebnisse sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung3, Abbildung4 dargestellt. Die Mäuse wurden mit Kohlendioxid euthaniert und im Unterbauch wurde mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 2A,B</strong…

Discussion

Mit zunehmendem Verständnis der universellen Rolle von RBPs unter biologischen und pathologischen Kontexten wurden die CLIP-Methoden weit verbreitet eingesetzt, um die molekulare Funktion der RBPs 20^,32,33zu zeigen. ^34,35. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine angepasste Anwendung der eCLIP-Methode auf Mäusehausweise dar.

E…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876