משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול eCLIP כדי לקבוע מטרות של RNA הגדולות של מועמדים RBP בתוך בנות.
Abstract
הזרע מגדיר תהליך מאוד מסודר של הבחנה של תא נבט זכר ביונקים. בתוך הראש, התמלול והתרגום אינם מצמידים, מפנים את החשיבות של בקרת הגנים שלאחר ההמרה של הביטוי הגנטי שאורגן על ידי RBPs. כדי להבהיר תפקידים מכניסטיים של RBP, מתודולוגיית immunoprecipitation מקשרת (CLIP) ניתן להשתמש כדי ללכוד מטרות ה-RNA הישיר שלה ולהגדיר את אתרי האינטראקציה בפועל. ה-CLIP המשופר (eCLIP) הוא שיטה שפותחה לאחרונה ומציעה מספר יתרונות על פני הקליפים הקונבנציונליים. עם זאת, השימוש ב-eCLIP הוגבל עד כה לקווי תאים, הקורא ליישומים מורחבים. כאן, העסקנו eCLIP ללמוד MOV10 ו MOV10L1, שני ידוע האליסים מחייב RNA, בתוך ביקורות העכבר. כצפוי, אנו מוצאים כי MOV10 בעיקר נקשר ל 3 ‘ אזורים בלתי מתורגמים (UTRs) של mRNA ו MOV10L1 בררנית נקשר Piwi-אינטראקציה RNA (piRNA) התעתיקים הקודמי. שיטת ה-eCLIP שלנו מאפשרת הגדרה מהירה של מינים מרכזיים של RNA המאוגדים על ידי RBPs שונים באמצעות רצף בקנה מידה קטן של תת-שיבוטים ובכך זמינות של ספריות מאושרות, כצו להליך ברצף עמוק. מחקר זה מבסס את הבסיס הרלוונטי ל-eCLIP בתוך בנות היונקים.
Introduction
התמיינות של מיונקים מייצגים מודל התפתחותי מעולה שבו תוכנית בידול התא מסובכים מפעילה מחזוריות להניב מספר רב של זרע. ערך ייחודי של מודל זה טמון הופעתה של הפעלה החוצה בשלבים מסוימים של הזרע, בדרך כלל כאשר כרומוזום הסקס meiotic הפעלה (msci) מתרחש1,2 וכאשר מסתובבים spermatogenesis קיצוני מדחס גרעיני במהלך spermiogenesis3. האירועים הללו ברציפות מחייבים את התקנה לאחר ההמרה של הגנים, שבו ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) לשחק תפקיד מכריע, עיצוב הטרנססקריפט ושמירה על פוריות הגבר.
כדי לזהות את מטרות ה-RNA בתום בודד של rbp הפרט ב-vivo, השיטה מרובי קישור immunoprecipitation (קליפ) פותחה4,5, על בסיס אבל מעבר RNA רגיל immunoprecipitation (RIP)6,7 , על ידי שילוב של שלבים מרכזיים כולל אולטרה סגול (UV) הקישור, לשטוף מחמירים ולהעביר ג’ל כדי לשפר את האות ספציפיות. היישום המתקדם של ה-CLIP בשילוב עם רצף תפוקה גבוהה עורר עניין רב ביצירת פרופיל של אינטראקציה חלבון-RNA ברמותהגנום-שמונה. בנוסף למחקרים גנטיים על הפונקציה RBP, כגון שיטות ביוכימיים המזהות את הגומלין הישיר של חלבון אנדוסוגני ו-RNA היו הכרחי כדי להבהיר במדויק את תפקידי הרגולציה של ה-RNA של Rbp. לדוגמה, MOV10L1 הוא הליקאז RNA הספציפי ביותר הנדרש עבור פוריות הגברי ו-Piwi-אינטראקציה RNA (piRNA) biogenesis9. Paralogue MOV10 שלה הוא ידוע בתור אוביקוויל rna הליקאז ו משולבות עם תפקידים בהיבטים רבים של ביולוגיה rna10,11,12,13,14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , 18. על ידי העסקת קליפ קונבנציונאלי-seq, מצאנו כי MOV10L1 נקשר ומסדיר pirna הראשונית מראש כדי ליזום עיבוד pirna מוקדם19,20, וכי MOV10 נקשר mrna 3 ‘ utrs ו כמו גם שאינם קידוד RNA מינים בתאי נבט האשכים (נתונים לא מוצגים).
עם זאת, CLIP הוא במקור הליך מפרך ורדיואקטיבי ואחריו הכנה לספריות ברצף עם אובדן מרשים של תגי CLIP. ב-CLIP המקובל, ספריית cDNA מוכנה באמצעות מתאמים משני הקצוות של RNA. לאחר עיכול החלבון, polypeptides קצרים קצר להישאר מקושרים שברי RNA. מארק זה מקשר באופן חלקי בלוקים לאחור טרנססקריפט (התקדמות) במהלך סינתזה cdna, וכתוצאה מכך cdnas המייצגים כ 80% של ספריית cdna21,22. כך, רק שברי cDNA הנובע RTase בורסה עוקף את האתר המקשר (קריאה-דרך) הם ברצף. לאחרונה, מספר הגישות השונות של CLIP, כגון PAR-קליפ, iCLIP, eCLIP ועובדה, מועסקים כדי לזהות אתרים מרובי קישורים של RBPs בתאי החיים. PAR-CLIP כולל את היישום של 365 ננומטר קרינת UV ו-photoהפעלות מקבילים והוא ולכן בלעדית לתאי החיים בתוך-culturing, והתאגדות של האנלוגיות של נוקלאוטיד לתוך תעתיקים מסונתז החדש נוטה לייצר הטיה כאשר RNA אינטראקציה פיזית עם חלבון23,24. ב-iCLIP, רק מתאם יחיד מחובר ל -3 הגפיים של קטעי RNA מקושרים. לאחר תמלול הפוכה (RT), שניהם מעוגלים ולקרוא על-ידי cdnas מתקבלים על ידי מעגליות ולינריזציה מחדש ואחריו תגובת שרשרת פולימראז (PCR) הגברה25,26. עם זאת, היעילות של מעגליות מולקולארית היא נמוכה יחסית. למרות שפרוטוקולי קליפ ישנים יותר זקוקים לתיוג של RNA מקושר עם רדיואיזוטופ, אולטרה-סגול מקשר וטיהור אהדה (למחוא כף), עם תהליך של טיהור דו-מושביים מחמירים, אינו מסתמך על רדיואקטיביות27. אף על פי כן, עובדה מוגבלת לתאים מתורבתים שחייבים להיות מצוידים עם וקטור הביטוי נושאת 3x דגל-HBH תג עבור טיהור האהדה הדו.
ב eCLIP, המתאמים היו ליגלו הראשון ב 3 ‘ הגפיים של RNA ואחריו RT, ובהמשך ב 3 ‘ הגפיים של cDNAs במצב הבין-מולקולרי. מכאן, eCLIP מסוגל ללכוד את כל מעוגלים ולקרוא ב-cDNA28. גם, זה לא מוגבל תיוג רדיואקטיבי, וגם לא באמצעות קווי התאים המבוססים על העיקרון שלה, תוך שמירה על הרזולוציה יחיד-נוקלאוטיד.
כאן, אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול eCLIP המותאם לגבי בעלי העכבר. בקצרה, זה הפרוטוקול eCLIP מתחיל עם מרובי UV המקשר של tubules האשכים, ואחריו העיכול חלקית RNase ו immunoprecipitation באמצעות נוגדן ספציפי חלבון. לאחר מכן, ה-RNA המאוגד לחלבון הוא בדיזאט, והמתאם מוגבל לקצה של שלושת האחרים. לאחר אלקטרופורזה ג’ל חלבונים ו ג’ל ל-ממברנה העברה, RNA מבודד על ידי חיתוך אזור הקרום של טווח בגודל צפוי. לאחר RT, מתאם DNA הוא ליגאל הקצה 3 ‘ של cDNA ואחריו הגברה PCR. הקרנה של תת-שיבוטים לפני רצף התפוקה הגבוהה נלקח כבקרת איכות בספרייה. פרוטוקול זה יעיל בזיהוי מינים עיקריים של רנ א חלבון מאוגד של RBPs, לידי ביטוי על ידי שתי הטיות ביטוי RNA האליסים MOV10L1 ו MOV10.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם ההבנה הגוברת של התפקיד האוניברסלי של rbps תחת שני ההקשרים ביולוגיים ופתולוגיים, שיטות הקליפ נוצל רבות כדי לחשוף את הפונקציה המולקולרית של rbps20,32,33, 34,35. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג יישום מותאם של שיטת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאריק ל ואן נוסטרנד ולג ‘ יו על הנחיות מועילות עם הפרוטוקול המקורי. K.Z. היה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771653). L.Y. נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81471502, 31871503) ותוכנית חדשנית ויזמית של מחוז ג’יאנגסו.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania） |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
| Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
| Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
| Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
| Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
| Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
| TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Reagents | |||
| Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
| Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
| DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
| DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
| ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
| Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
| FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
| LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
| MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
| MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
| MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
| NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
| NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
| Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
| proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
| Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
| RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
| RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
| RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
| Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
| SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
| T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
| T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
| TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
| TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
| Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
| X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |
References
- Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
- Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
- Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
- Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
- Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
- Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
- Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).
- Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
- Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
- Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).
- Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).
- Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
- Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).
- Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
- Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
- Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
- Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
- Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).
