Förbättrad crosslinking Immunutfällning (eCLIP) metod för effektiv identifiering av protein-bundet RNA i mus testis
Summary
Här presenterar vi ett eCLIP-protokoll för att fastställa viktiga RNA-mål för RBP-kandidater i testis.
Abstract
Spermatogenes definierar en högt beställd process av manlig köns cell differentiering hos däggdjur. I testis, transkription och översättning är okopplade, understryker vikten av post-transkriptionell reglering av gen uttryck iscensatt av RBPs. För att belysa mekanistiska roller i en RBP, crosslinking immunutfällning (CLIP) metodik kan användas för att fånga dess endogena direkt RNA mål och definiera de faktiska interaktions platser. Den förstärkta CLIP (eCLIP) är en nyutvecklad metod som erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella CLIPs. Dock har användningen av eCLIP hittills begränsats till cellinjer, vilket kräver utökade tillämpningar. Här använde vi eCLIP för att studera MOV10 och MOV10L1, två kända RNA-bindande helicases, i mus testis. Som väntat, finner vi att MOV10 huvudsakligen binder till 3 “oöversatta regioner (UTRs) av mRNA och MOV10L1 selektivt binder till piwi-interagerande RNA (piRNA) föregångare transkriptioner. Vår eCLIP metod tillåter snabb bestämning av stora RNA arter bundna av olika RBPs via småskalig sekvensering av subkloner och därmed till gång till kvalificerade bibliotek, som en teckningsoption för att fortsätta med djup sekvensering. I denna studie fastställs en tillämplig grund för eCLIP i testis i däggdjurs celler.
Introduction
Däggdjurs testiklarna representerar en utmärkt utvecklings modell där en intrikata cell differentiering program löper cykliskt att ge många spermatozoa. Ett unikt värde av denna modell ligger i uppkomsten av transkriptionell inaktive ring vid vissa stadier av spermatogenes, typiskt när meiotiska kön kromosom inaktive ring (MSCI) inträffar1,2 och när runda spermatider genomgå drastiska nukleär packning under spermiogenesis3. Dessa inpå varandra följande transkriptionella händelser nödvändiggör post-transkriptionell gen reglering, där RNA-bindande proteiner (RBPs) spelar en avgörande roll, forma transkriptome och bibehålla manlig fertilitet.
För att identifiera de bona fide RNA-målen för en individuell RBP in vivo, den crosslinking immunutfällning (Clip)-metoden utvecklades4,5, baserat på men bortom den vanliga RNA immunonederbörden (RIP)6,7 , genom införlivande av viktiga steg inklusive ultraviolett (UV) crosslinking, stränga tvätta och gel överföring för att förbättra signalspecificitet. Den avancerade tillämpningen av CLIP kombinerat med hög genom strömning sekvensering har provocerat stort intresse för profilering av protein-RNA interaktion på genomtäckande nivåer8. Förutom genetiska studier av RBP-funktion har sådana biokemiska metoder som identifierar det direkta samspelet mellan endogent protein och RNA varit oumbärliga för att exakt belysa RNA-regulatoriska roller i RBPs. Till exempel, MOV10L1 är en testis-specifika RNA helicase krävs för manlig fertilitet och piwi-interagerande RNA (Pirna) biogenes9. Dess paralogue MOV10 är känd som en ubiquitously uttryckt och multifunktionella RNA helicase med roller i flera aspekter av RNA biologi10,11,12,13,14 , 15 , 16 för att , 17 i den , 18. genom att använda den konventionella Clip-SEQ fann vi att MOV10L1 binder och reglerar primära Pirna prekursorer för att initiera tidig Pirna bearbetning19,20, och att MOV10 binder mRNA 3 ‘ utrs och liksom icke-kodning RNA arter i testikelköns celler (data visas inte).
Ändå är CLIP ursprungligen ett mödosamt, radioaktivt förfarande följt av sekvensering bibliotek förberedelse med en anmärknings värd förlust av CLIP Taggar. I den konventionella Clip, ett cDNA-bibliotek förbereds med adaptrar liga turer på båda RNA extremiteter. Efter protein nedbrytning förblir tvär bundna korta polypeptider knutna till RNA-fragment. Detta crosslinking mark delvis blockerar omvänd transkriptase (rtase) progression under cDNA syntes, vilket resulterar i trunkerade cdnas som representerar cirka 80% av cDNA-biblioteket21,22. Sålunda, bara cDNA fragment resulterande från RTase förbifartsleden den crosslinking tomt (läsa-igenom) är sekvenserade. På senare tid har olika CLIP-metoder, som PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP och uvCLAP, använts för att identifiera tvär bindnings platser för RBPs i levande celler. PAR-CLIP innebär tillämpning av 365 nm UV-strålning och photoactivatable nukleotid analoger och är därför exklusivt för in-odling av levande celler, och inkorporering av nukleosidanaloger till nyligen syntetiserade utskrifter är benägna att producera bias där RNA fysiskt interagerar med protein23,24. I iclip, endast en enda adapter är liga turer till 3 ‘ extremiteterna av tvär bunden RNA fragment. Efter Omvänd transkription (RT), både trunkerad och genomläsning cdnas erhålls genom intramoleculärt cirkularization och re-linearization följt av polymeras kedje reaktion (PCR) amplifiering25,26. Emellertid, effektiviteten i Intramolekylär cirkularisering är relativt låg. Även äldre CLIP-protokoll behöver märkning av tvär bunden RNA med en radio isotop, ultraviolett tvär bindning och affinitet rening (uvCLAP), med en process av stränga tandem affinitet rening, inte förlita sig på radio aktivitet27. Icke desto mindre, uvclap är begränsad till odlade celler som måste transfekterade med uttrycket vektor bär 3x Flag-HBH tagg för tandem affinitet rening.
I eclip, var adaptrar liga turer först vid 3 ‘ extremiteterna av RNA följt av RT, och nästa vid 3 ‘ extremiteten av cdnas i ett intermolekylärt läge. Sålunda, eCLIP är köpa duktig ta till fånga all stympat och läsa-igenom cDNA28. Dessutom är det varken begränsat till radioaktivt märkning, eller att använda cellinjer baserat på dess princip, samtidigt som en enda-nukleotid upplösning.
Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av ett eCLIP-protokoll anpassat för mus testis. Kortfattat, detta eCLIP protokollet börjar med UV-crosslinking av testikeltubuli, följt av partiell RNase mat smältning och immunonederbörd med hjälp av en proteinspecifik anti kropp. Nästa, proteinet-bundet RNA är defosforylated, och adaptern är liga turer till dess 3 ‘. Efter protein gel elektrofores och gel-till-membran överföring, RNA isoleras genom att skära membranet området i en förväntad storleks intervall. Efter RT, DNA-adapter är liga turer till 3 ‘ slutet av cDNA följt av PCR amplifiering. Screening av subkloner före hög genom strömning sekvensering tas som ett bibliotek kvalitets kontroll. Detta protokoll är effektivt på att identifiera viktiga arter av protein-bundet RNA av RBPs, exemplifieras av de två testis-uttrycker RNA Helikas MOV10L1 och MOV10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med ökad förståelse för den universella roll RBPs under både biologiska och patologiska sammanhang, har klippet metoder använts i stor utsträckning för att avslöja den molekyl ära funktionen av RBPs20,32,33, 34,35. Protokollet som beskrivs här representerar en anpassad tillämpning av eCLIP metod för att musen testis.
E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Eric L van Nostrand och Gene W Yeo för användbar vägledning med det ursprungliga protokollet. K.Z. stöddes av den nationella nyckeln R & D-programmet i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) och Kinas nationella Naturvetenskaps stiftelse (31771653). L.Y. stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) och innovativa och entreprenörs program i Jiangsu-provinsen.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania） |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
| Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
| Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
| Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
| Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
| Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
| TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Reagents | |||
| Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
| Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
| DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
| DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
| ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
| Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
| FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
| LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
| MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
| MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
| MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
| NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
| NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
| Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
| proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
| Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
| RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
| RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
| RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
| Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
| SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
| T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
| T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
| TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
| TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
| Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
| X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |
References
- Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids. Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).
- Turner, J. M. A. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
- Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
- Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37 (4), 376-386 (2005).
- Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).
- Zheng, K., et al. Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway. Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).
- Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5′ to 3′ RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3′ UTRs. Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).
- Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation. Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).
- Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).
- Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells. PLoS Genetics. 8 (10), e1002941 (2012).
- Haussecker, D., et al. Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).
- Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).
- Messaoudi-Aubert, S. E., et al. Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).
- Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data. Nucleic Acids Research. 40 (20), e160 (2012).
- Skariah, G., et al. Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain. BMC Biology. 15 (1), 54 (2017).
- Zheng, K., Wang, P. J. Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity. PLoS Genetics. 8 (11), e1003038 (2012).
- Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
- Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions. Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).
- Huppertz, I., et al. iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins. Nature Communications. 9 (1), 1142 (2018).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnology. 11, 24 (2011).
- Breunig, C. T., et al. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
- Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. The UCSC genome browser and associated tools. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).
- Vourekas, A., et al. Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).
- Preitner, N., et al. APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly. Cell. 158 (2), 368-382 (2014).
- Meyer, C., et al. The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression. Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Vourekas, A., Mourelatos, Z. HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins. Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).
