Método de inmunoprecipitación de reticulado mejorado (eCLIP) para la identificación eficiente de ARN ligado a proteínas en Testis del ratón

Summary

Aquí, presentamos un protocolo eCLIP para determinar los principales objetivos de ARN de los candidatos a RBP en Testis.

Abstract

La espermatogénesis define un proceso altamente ordenado de diferenciación de células germinales masculinas en mamíferos. En los Testis, la transcripción y la traducción están desacopladas, subrayando la importancia de la regulación post-transcripcional de la expresión génica orquestada por las RBP. Para dilucidar las funciones mecanicistas de un RBP, la metodología de reticulación inmunoprecipitation (CLIP) se puede utilizar para capturar sus objetivos de ARN directo endógeno y definir los sitios de interacción reales. El CLIP mejorado (eCLIP) es un método desarrollado recientemente que ofrece varias ventajas sobre los CLIPs convencionales. Sin embargo, el uso de eCLIP hasta ahora se ha limitado a las líneas celulares, pidiendo aplicaciones ampliadas. Aquí, empleamos a eCLIP para estudiar MOV10 y MOV10L1, dos helicasas de unión a ARN conocidas, en Testis de ratón. Como era de esperar, encontramos que MOV10 se une predominantemente a 3 ‘ regiones no traducidas (UTRs) de mRNA y MOV10L1 se une selectivamente a las transcripciones de precursores de ARN interactuante de Piwi (piRNA). Nuestro método eCLIP permite la rápida determinación de las principales especies de ARN vinculadas por diversos RBPs mediante la secuenciación a pequeña escala de subclones y, por lo tanto, la disponibilidad de bibliotecas calificadas, como una orden de proceder con secuenciación profunda. Este estudio establece una base aplicable para la eCLIP en los testículos de mamífero.

Introduction

Los testículos de mamífero representan un excelente modelo de desarrollo en el que un intrincado programa de diferenciación celular se ejecuta cíclicamente para producir numerosos espermatozoides. Un valor único de este modelo radica en la aparición de la inactivación transcripcional en ciertas etapas de la espermatogénesis, típicamente cuando la inactivación cromosómica del sexo meióticos (MSCI) ocurre^1,2 y cuando los spermatidos redondos se someten a compactación nuclear drástica durante la espermiogénesis³. Estos eventos transcripcionales inconsecutivos requieren la regulación del gen post-transcripcional, en el cual las proteínas de unión al ARN (RBP) desempeñan un papel crucial, dando forma al transcriptoma y manteniendo la fertilidad masculina.

Para identificar los objetivos de ARN Bona fide de un RBP individual in vivo, el método de inmunoprecipitación reticulante (clip) se desarrolló^4,5, basado en pero más allá de la inmunoprecipitación de ARN regular (RIP)^6,7 , mediante la incorporación de pasos clave, incluyendo la reticulación ultravioleta (UV), el lavado estricto y la transferencia de gel para mejorar la especificidad de la señal. La aplicación avanzada del CLIP combinado con la secuenciación de alto rendimiento ha provocado un gran interés en el perfilado de la interacción proteína-ARN a niveles de genoma amplio⁸. Además de los estudios genéticos sobre la función de la RBP, estos métodos bioquímicos que identifican la interacción directa de la proteína endógena y el ARN han sido indispensables para dilucidar con precisión las funciones reguladoras de ARN de los RBPs. Por ejemplo, MOV10L1 es una helicasa de ARN específica de testis necesaria para la fertilidad masculina y la biogénesis⁹del ARN interactuante Piwi (Pirna). Su MOV10 de parálogo es conocido como un ARN helicogenamente expresado y multifuncional con funciones en múltiples aspectos de la biología de ARN^{10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18}. mediante el empleo de los clip-SEQ convencionales, descubrimos que MOV10L1 une y regula los precursores primarios de Pirna para iniciar el procesamiento temprano de Pirna^19,20, y que MOV10 une mRNA 3 ‘ UTRs y así como ARN no codificante especies en células germinales testiculares (datos no mostrados).

Sin embargo, CLIP es originalmente un laborioso, procedimiento radiactivo seguido por secuenciación de preparación de la biblioteca con una notable pérdida de etiquetas CLIP. En el CLIP convencional, se prepara una biblioteca cDNA utilizando adaptadores ligados en ambas extremidades del ARN. Después de la digestión proteica, los polipéptidos cortos reticulados permanecen Unidos a los fragmentos de ARN. Esta marca reticulante bloquea parcialmente la progresión de la transcriptasa inversa (rtasa) durante la síntesis de cDNA, resultando en cDNAs truncados que representan alrededor del 80% de la biblioteca de cDNA^21,22. Por lo tanto, sólo fragmentos de cDNA resultantes de la Rtasa omitiendo el sitio de reticulación (lectura a través) están secuenciados. Recientemente, varios enfoques CLIP, tales como PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP y uvCLAP, se han empleado para identificar sitios de enlace cruzado de RBPs en las células vivas. PAR-CLIP involucra la aplicación de radiación UV de 365 nm y análogos de nucleótidos fotoactivables y, por lo tanto, es exclusivo de las células vivas en cultivo, y la incorporación de análogos de nucleósidos en transcripciones recién sintetizadas es propensa a producir sesgo donde el ARN interactúa físicamente con la proteína^23,24. En iCLIP, sólo un adaptador se ligaba a la extremidad 3 ‘ de los fragmentos de ARN reticulado. Después de la transcripción inversa (RT), las cDNAs truncadas y de lectura a través se obtienen mediante la circularización intramolecularmente y la relinearización seguida de la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)^25,26. Sin embargo, la eficiencia de la circularización intramolecular es relativamente baja. Aunque los protocolos CLIP más antiguos necesitan etiquetar ARN reticulada con un radioisótopo, la reticulación ULTRAVIOLETA y la purificación de afinidad (uvCLAP), con un proceso de purificación de afinidad en tándem estricta, no dependen de la radioactividad²⁷. Sin embargo, uvclap se limita a las células cultivadas que deben ser transfectadas con el vector de expresión que lleva la etiqueta 3x Flag-HBH para la purificación de afinidad en tándem.

En eCLIP, los adaptadores fueron ligados primero en la extremidad 3 ‘ de ARN seguido por RT, y al lado de la 3 ‘ extremidad de cDNAs en un modo intermoleculares. Por lo tanto, eCLIP es capaz de capturar todos truncados y leídos-a través de cDNA²⁸. Además, no está restringido al etiquetado radioactivo, ni al uso de líneas celulares basadas en su principio, manteniendo al mismo tiempo la resolución de un solo nucleótido.

Aquí, proporcionamos una descripción paso a paso de un protocolo eCLIP adaptado para los Testis del ratón. Brevemente, este protocolo eCLIP comienza con la reticulación UV de los túbulos testiculares, seguidos por la digestión parcial de la RNase e inmunoprecipitation usando un anticuerpo específico de proteína. A continuación, el ARN ligado a proteínas está desfosforilado, y el adaptador se ligaba a su extremo 3 ‘. Después de la electroforesis de gel de proteína y la transferencia de gel a membrana, el ARN se aísla cortando el área de la membrana de un rango de tamaño esperado. Después de RT, el adaptador de ADN está ligado al extremo 3 ‘ de cDNA seguido por la amplificación de PCR. El cribado de subclones antes de la secuenciación de alto rendimiento se toma como un control de calidad de la biblioteca. Este protocolo es eficiente en la identificación de las principales especies de ARN ligado a proteínas de RBP, ejemplificado por los dos ARN que expresan las helicasas MOV10L1 y MOV10.

Protocol

Todos los experimentos realizados con animales han sido aprobados por el Comité de la Universidad médica de Nanjing. Los ratones masculinos C57BL/6 se mantuvieron bajo condiciones de fotoperiodo controladas y se suministraron con alimentos y agua. 1. recolección de tejido y reticulación UV Eutanasia 2 ratones adultos con dióxido de carbono (CO2) durante 1-2 min o hasta que la respiración se detenga. A continuación, realice la dislocación cervical en cada ratón.</l…

Representative Results

El procedimiento eclip y los resultados se ilustran en la figura 1, figura 2, figura 3, figura 4. Los ratones fueron eutanizados con dióxido de carbono y se hizo una pequeña incisión en la parte inferior del abdomen usando tijeras quirúrgicas (fi…

Discussion

Con el aumento de la comprensión del papel universal de la RBP en contextos biológicos y patológicos, los métodos de clip han sido ampliamente utilizados para revelar la función molecular de RBPs^{20,32,33, 34,35}. El protocolo descrito aquí representa una aplicación adaptada del método eCLIP a los Testis del ratón.

Un desaf?…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876