肌肉活检中的免疫标记肌纤维退化
Summary
这里描述的是肌肉冷冻科坏死肌纤维直接免疫标签的协议。坏死细胞可渗透到血清蛋白，包括免疫球蛋白G（IgG）。揭示肌纤维对IgG的摄取，允许识别和定量肌纤维，无论肌肉状况如何，都会发生坏死。
Abstract
肌肉纤维坏死（肌骨病）在多种肌肉状况的发病机制中起着核心作用，包括肌肉萎缩症。解决肌肉营养不良发病机制原因的治疗方案有望缓解肌肉退化。因此，需要一种方法来测定和量化肌肉活检中细胞死亡的程度。观察原位肌纤维退化的常规方法要么定量不足，要么依靠注射重要染料。本文描述了免疫荧光方案，通过靶向肌纤维的免疫球蛋白G（IgG）的摄入来染色坏死肌纤维。IgG的取法基于细胞特征特征，包括1）血浆膜完整性的丧失与损伤相关的分子模式的释放，以及2）血浆蛋白的接受。在鼠阵横截面中，肌纤维、细胞外基质蛋白和小鼠IgG的共免疫标签允许对肌纤维进行清洁和直接的识别，并造成坏死的命运。这种简单的方法适用于定量分析，适用于所有物种，包括人类样品，并且不需要注射重要染料。IgG吸收对坏死肌纤维的染色也可以与其他共免疫标签搭配使用。
Introduction
骨骼肌主要由肌肉纤维（肌纤维）组成，这些纤维负责典型的自愿收缩功能。这些细胞是多核的后线结构，支持收缩过程中发生的机械应力。肌纤维膜（沙科雷马）及其细胞外基质的结构稳定性对组织平衡至关重要。卫星细胞构成成熟骨骼肌中的主要肌肉祖体群体，在健康肌肉中处于静止状态。在肌纤维死亡后，肌肉再生由卫星细胞支持，其后是一个涉及卫星细胞活化、增殖、分化和融合的肌基程序，最终形成新的多核肌纤维。
肌纤维死亡可能发生在多种肌肉条件，包括机械创伤，缺血再灌注损伤，或肌肉营养不良，它与死细胞1，2的坏死形态相关。死神死亡的特点是血浆膜的快速渗透和细胞外腔室细胞含量的释放3。它可能导致一个不受管制的过程，没有适当的细胞信号（即意外坏死），或经过编排的细胞内通路（即调节坏死）。在肌纤维中，调节的4和未调节的5个过程都可能导致坏死。阴囊炎的典型后果是释放损伤相关分子模式，激活强大的炎症反应6。在7号受伤后，在48小时和72小时观察到巨噬细胞的存在。除了在清除坏死碎片中的作用，它们在肌肉再生8，9也很重要。
肌肉萎缩症（MDs）是一个异质的病理学组，通常由沙科勒马结构的缺陷引起。杜琴肌肉萎缩症（DMD）是一种青少年X相关疾病，影响全球每3，500名男性出生10个，并且是由沙眼缺乏肌营养不良素表达引起的。DMD男孩肌肉组织的慢性退化会导致极度肌肉无力和过早死亡。坏死引起的炎症增强细胞毒性，促进肌肉纤维化和肌肉功能丧失11，12。目前针对肌肉退行性疾病根源的临床试验，如基因治疗，有望缓解肌功能障碍。因此，需要简单的技术来准确量化肌肉退化。
一些方法通常用于监测体内肌纤维损失。测量血液中肌酸激酶 （CK） 的酶活性，可以可靠地定量肌肉和心脏组织中持续的坏死。原位，血氧林和欧辛（H&E）染色是目前用于诊断评估变性再生重塑的最流行的方法。然而，死细胞H&E标签的分子基础仍不清楚。此外，表明H&E染色中肌纤维死亡的色彩修饰相对微妙，不利于可靠和可重复的定量。揭示DNA分块的方法，如端溶脱氧核糖核酸酶转移酶dUTP刻末标签（TUNEL），不完全标称坏死死亡3。它们也不太适应监测同步细胞（如肌纤维）的死亡。注射重要的染料，如埃文的蓝色染料（EBD），是评估已经失去沙科雷马完整性的肌纤维的有用替代品，但在某些实验协议中不一定方便。例如，血液样本中EBD的存在会影响CK测量的结果，这是一种色度测定。此外，细胞内对EBD的接受使得共免疫标签具有挑战性。因此，允许直接标记患有坏死的肌纤维的替代方法是值得关注的。
重要染料的作用机制依赖于坏死肌纤维中血浆膜完整性的丧失和注射染料的被动接受。同样，坏死肌纤维摄入血液蛋白，如白蛋白，其中EBD具有很强的亲和力13，14，免疫球蛋白G（IgG）和IgM15。因此，肌纤维中血液蛋白的异常存在为原位肌骨细胞分不位提供了方便的标记物。染色这些蛋白质可以是使用重要染料的替代方法。
通过使用IgG的接受作为原位肌性骨症的标记，此方案用于评估mdx营养不良症小鼠的tibialis前（TA）的肌肉退化。与替代方法技术不同，该方法具有显著的优势：1）其可重复性和执行简单性;2） 在肌肉收集之前不需要任何动物治疗，如注射循环的重要染料，以及3）作为任何常规免疫标签，它与共标签兼容。
Protocol
Representative Results
Discussion
肌纤维坏死是正常肌肉创伤性运动的一个常见后果。它由本地肌肉祖孕者强大的再生能力很好地补偿。然而，在一些肌肉状况，如在MD，卫星细胞的再生能力受到慢性肌瘤病和过度纤维化的影响。最近的发现表明，肌肉纤维可以死于坏死，一种受管制的坏死形式。更具体地说，抑制肾上一代可能成为DMD治疗4的新治疗策略。调查肌肉退化障碍的细胞死亡途径需要可靠的肌肉细胞死?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了法国与异体病协会的支持。作者感谢佩拉·雷耶斯-费尔南德斯博士和马修·博罗克博士认真阅读手稿。
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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