근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성
Summary
여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.
Abstract
근육 섬유의 괴사 (myonecrosis)는 근육 이영양증을 포함한 여러 근육 조건의 발병 기전에서 중심적인 역할을합니다. 근 위축병발생의 원인을 해결하는 치료 옵션은 근육 변성을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 생검에서 세포 사멸 정도를 분석하고 정량화하는 방법이 필요하다. 종래의 방법은 장소에서 근섬유 변성을 관찰하는 것이 양적 또는 필수 염료의 주입에 의존한다. 본 문서에서, 면역형광 프로토콜은 myofibers에 의한 면역글로불린 G(IgG) 섭취량을 표적으로 하여 괴사 된 myofibers를 염색하는 것을 기술한다. IgG 섭취 방법은 1) 손상 관련 분자 패턴의 방출과 함께 혈장 막 무결성의 손실 및 2) 혈장 단백질의 섭취를 포함하여 괴사 멸망을 특징짓는 세포 특징을 기반으로 한다. 뮤린 단면에서, myofibers, 세포외 매트릭스 단백질 및 마우스 IgG의 공동 면역 표지는 괴사 운명과 myofibers의 깨끗하고 간단한 식별을 허용합니다. 이 간단한 방법은 정량 분석에 적합하고 인간 샘플을 포함한 모든 종에 적용 가능하며, 필수 염료의 주입을 필요로하지 않는다. IgG 섭취량에 의한 괴사 성 myofibers의 염색은 또한 다른 공동 면역 라벨링과 결합 될 수 있습니다.
Introduction
줄무늬 골격근은 주로 특징적인 자발적 수축 기능을 담당하는 근육 섬유 (myofibers)로 구성됩니다. 이 세포는 수축 도중 일어나는 기계적인 응고를 지원하는 다중 핵화, 포스트 유사분열 구조물입니다. 근섬유소막(사르콜엠마)과 세포외 매트릭스의 구조적 안정성은 조직 항상성에 매우 중요합니다. 위성 세포는 성숙한 골격 근에서 주요 근육 전구 집단을 구성하고 건강한 근육에서 정지 상태에 존재한다. myofiber 죽음 다음, 근육 재생은 궁극적으로 새로운 다핵근 화파이버를 형성하기 위해 위성 세포 활성화, 증식, 분화 및 융합을 포함하는 myogenic 프로그램을 따르는 위성 세포에 의해 지원됩니다.
Myofiber demise는 기계적 외상, 허혈 재관류 상해, 또는 근육 이영양증을 포함하는 다중 근육 조건에서 생길 수 있고, 죽은 세포의 괴사 형태와 연관된다1,2. 괴사염은 혈장막의 급속한 투과성 및 세포외 구획내의 세포 함량의 방출을 특징으로한다 3. 그것은 적절한 세포 신호 (즉, 우발적 인 괴사) 또는 오케스트레이션 된 세포 내 통로 (즉, 조절 된 괴사)를 포함하는 관계가없는 과정중 하나에서 발생할 수 있습니다. myofibers에서, 규제4 및 관계가 없는5 프로세스 는 괴사로 이어질 수 있습니다. 근위병의 전형적인 결과는 손상 관련 분자 패턴의 방출이며, 강력한 염증반응을활성화6. 대식세포의 존재는 부상7다음 약 48 시간 및 72 시간에서 관찰된다. 괴사 파편의 정리에 있는 그들의 역할 이외에, 그(것)들은 또한 근육 재생에 중요합니다8,9.
근 위축증 (MDs)은 종종 사르콜렘 구조의 결함으로 인한 이질적인 병리학 그룹입니다. Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 전 세계 3,500명의 남성 출생 중 대략1에영향을 미치는 청소년 X 연결된 질병이고, sarcolemma에 dystrophin 표현의 부재에 기인합니다. DMD 소년에서 근육 조직의 만성 변성 극단적인 근육 약점 및 초기 사망에 이르게. 괴사에 의한 염증은 세포 독성을 향상시키고 근육 섬유증및 근육 기능의 상실을 촉진한다11,12. 유전자 치료와 같은 근육 퇴행성 질환의 뿌리를 대상으로 하는 임상 시험에서 현재 치료는 근위대증을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 변성을 정확하게 정량화하는 간단한 기술이 필요합니다.
생체 내에서 근섬유 손실을 모니터링하기 위해 여러 가지 방법이 일상적으로 사용됩니다. 혈액내 크레아틴 키나아제(CK)의 효소 활성을 측정하면 근육과 심장 조직에서 지속적인 괴사의 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다. 이 시장에서 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색은 변성 재생 재생을 평가하기 위해 현재 진단에 사용되는 가장 인기 있는 방법입니다. 그러나, 죽은 세포의 H&E 라벨링의 분자 기초는 불분명남아 있습니다. 또한 H&E 염색에서 myofiber 죽음을 암시하는 색상 수정은 상대적으로 미묘하며 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량화를 용이하게하지 않습니다. DNA 단편화를 밝히는 방법, 예: 말단 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL), 불완전 라벨 괴사3. 그(것)들은 또한 myofibers와 같은 동기화한 세포의 죽음을 감시하기 위하여 제대로 적응됩니다. Evan의 청색 염료 (EBD)와 같은 중요한 염료의 주입은 사르콜렘의 무결성을 잃은 근섬유를 평가하기위한 유용한 대안을 나타내지만 일부 실험 프로토콜에서 반드시 편리하지는 않습니다. 예를 들면, 혈액 샘플에 있는 EBD의 존재는 CK 측정, colorimetric 분석결과의 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, EBD의 세포 내 섭취는 공동 면역 라벨링을 어렵게 만듭니다. 따라서 괴사를 겪고있는 myofibers의 직접 라벨링을 허용하는 대체 방법이 흥미 로고입니다.
중요한 염료의 작용 메커니즘은 괴사 성 myofibers의 플라즈마 막 무결성의 손실과 주입 된 염료의 수동 적인 섭취에 의존합니다. 유사하게, 괴사성 근섬유는 알부민과 같은 혈액 단백질을 섭취하며, 이는 EBD가 강한 친화성을 가지는13,14,면역글로불린 G(IgG) 및 IgM15이다. 따라서 myofibers 내의 혈액 단백질의 이상한 존재는 구내에서 근위대근에 대한 편리한 마커를 나타냅니다. 이 단백질을 염색하는 것은 중요한 염료의 사용을 위한 대안이 될 수 있습니다.
IgG 섭취량을 중계근의 마커로 사용하여, 이 프로토콜은 mdx 디스트로핀 결핍 마우스의 경골 전방(TA)에서 근육 변성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 대체 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다: 1) 실행시 재현가능하고 간단합니다. 2) 순환하는 필수 염료의 주입과 같은 근육 수집 전에 어떠한 동물 치료도 필요하지 않으며, 3) 임의의 통상적인 면역라벨링으로서, 공동 라벨링과 호환된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber 괴사는 정상적인 근육에서 외상성 운동의 일반적인 결과입니다. 그것은 잘 로컬 근육 선조의 강력한 재생 능력에 의해 보상. 그러나, 여러 근육 조건에서 MDs에서, 위성 세포의 재생 용량 만성 근조와 과도 한 섬유 증에 의해 손상. 최근 연구 결과에 따르면 근육 섬유는 괴사의 규제 형태인 necroptosis에 의해 죽을 수 있습니다. 보다 구체적으로, necroptosis의 억제는 DMD 처리를 위한 새로운 치료 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Translamuscle 프로그램과 협회 프랑수아즈 콘트레 레 Myopathies에 의해 지원되었다. 저자들은 펄라 레예스-페르난데스 박사와 매튜 보록 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사를 표합니다.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
