筋生検における免疫標識筋線維変性
Summary
ここで説明するプロトコルは、筋凍結切片における壊死性筋線維の直接免疫標識のためのプロトコルである。壊死細胞は、免疫グロブリンG(IgG)を含む血清タンパク質に透過性である。ミオファイバーによるIgGの取り込みを明らかにすることで、筋肉の状態に関係なく壊死を起こす筋線維の同定と定量を可能にする。
Abstract
筋線維の壊死(ミオネクロシス)は、筋ジストロフィーを含むいくつかの筋肉疾患の病因において中心的な役割を果たす。筋ジストロフィー病因の原因に対処する治療オプションは、筋肉の変性を緩和することが期待される。そのため、筋生検における細胞死の程度をアッセイおよび定量する方法が必要である。その上でミオファイバー変性を観察する従来の方法は、定量性が低いか、または重要な色素の注入に依存する。本稿では、免疫蛍光プロトコルは、ミオファイバーによる免疫グロブリンG(IgG)取り込みを標的とすることにより壊死性ミオファイバーを染色することを説明する。IgG取り込み方法は、1)損傷関連分子パターンの放出による血漿膜完全性の喪失および2)血漿タンパク質の取り込みを含む、壊死性の破壊を特徴とする細胞特徴に基づいている。マウス断面では、ミオファイバー、細胞外マトリックスタンパク質、マウスIgGの共免疫標識により、壊死性の運命を持つミオファイバーのクリーンで簡単な同定が可能になります。この簡単な方法は、定量分析に適しており、ヒトサンプルを含むすべての種に適用可能であり、重要な色素の注入を必要としません。IgG取り込みによる壊死性ミオファイバーの染色は、他の共免疫標識と対緒することもできる。
Introduction
縞状の骨格筋は、主に筋線維(筋線維)で構成され、特徴的な自発的収縮機能を担います。これらの細胞は、収縮中に発生する機械的ストレスをサポートする多核化された、有糸後の構造です。ミオファイバー膜(サルコレンマ)とその細胞外マトリックスの構造安定性は、組織恒常性のために重要である。衛星細胞は、成熟した骨格筋の主要な筋肉前駆集団を含み、健康な筋肉の静止状態に存在する。筋線維死後、筋再生は、衛星細胞の活性化、増殖、分化、融合を伴う筋細胞によって、最終的に新しい多核性ミオファイバーを形成する衛星細胞によって支持される。
ミオファイバーの消滅は、機械的外傷、虚血再灌流傷害、または筋ジストロフィーを含む複数の筋肉状態で起こり得、そして死細胞1、2の壊死形態に関連している。壊死は、形質膜の急速な透過性および細胞外コンパートメント3における細胞含有量の放出によって特徴付される。これは、適切な細胞シグナル伝達を伴う無秩序なプロセス(すなわち、偶発的壊死)、または調整された細胞内経路(すなわち、調節された壊死)のいずれかから生じ得る。ミオファイバーでは、規制された4プロセスと規制されていない5プロセスの両方が壊死につながる可能性があります。ミオネクロシスの典型的な結果は、損傷関連分子パターンの放出であり、強力な炎症反応を活性化する6。マクロファージの存在は、傷害7に続いて約48時間および72時間で観察される。壊死性残骸のクリアランスにおける彼らの役割に加えて、それらはまた、筋肉再生8、9で重要である。
筋ジストロフィー(MD)は、しばしばサルコレンマ構造の欠陥から生じる病理の異種グループである。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、世界中の3,500人の男性出生のうち約1人に影響を及ぼす若年性X結合疾患であり、サルコレンマにおけるジストロフィン発現の欠如によって引き起こされる。DMD少年の筋肉組織の慢性変性は、極端な筋力低下と早期死亡率につながる。壊死に起因する炎症は、細胞傷害性を増強し、筋線維化および筋機能の喪失を促進する11、12。現在、遺伝子治療などの筋肉変性疾患の根源を標的とした臨床試験中の治療法は、ミオネクロシスの緩和が期待されています。したがって、筋肉の変性を正確に定量する簡単な技術が必要です。
生体内のミオファイバー損失を監視するためにいくつかの方法が日常的に使用されます。血液中のクレアチンキナーゼ(CK)の酵素活性の測定は、筋肉および心臓組織における進行中の壊死の信頼性の高い定量を可能にする。現場では、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色は、変性再生リモデリングを評価するために診断に現在使用されている最も一般的な方法です。しかしながら、死細胞のH&E標識の分子基盤は不明のままである。さらに、H&E染色におけるミオファイバー死を示唆する色の改変は比較的微妙であり、信頼性が高く再現性の高い定量化を促進しない。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)などのDNA断片化を明らかにする方法は、不完全な標識壊死3。彼らはまた、ミオファイバーなどの同期細胞の死を監視するために不十分に適応されています。エヴァンの青色染料(EBD)のような重要な染料の注入は、サルコレンマの完全性を失ったミオファイバーを評価するのに有用な代替手段を表すが、一部の実験プロトコルでは必ずしも便利ではない。例えば、血液サンプル中のEBDの存在は、CK測定、比色アッセイの結果に影響を与えることができる。さらに、EBDの細胞内取り込みは、共免疫標識を困難にする。したがって、壊死を受けている筋線維の直接表示を可能にする代替方法が興味深い。
重要な色素の作用機序は、壊死性筋線維における血漿膜完全性の喪失と注入された色素の受動的な取り込みに依存する。同様に、壊死性筋線維は、アルブミンなどの血液タンパク質を取り込み、EBDが強い親和性を有する13、14、免疫グロブリンG(IgG)、およびIgM15である。したがって、ミオファイバー内の血液タンパク質の異常な存在は、その上のミオクロス症のための便利なマーカーを表します。これらのタンパク質を染色することは、重要な染料の使用のための代替手段であることができます。
IgG取り込みを上座でのミオネクロシスのマーカーとして使用することにより、このプロトコルは、mdxジストロフィン欠損マウスの脛骨前(TA)における筋肉変性を評価するために使用される。この方法は、代替技術よりも大きな利点を提示します: 1) 再現性があり、実行が簡単です。2)循環性重要色素の注入などの筋肉採取前の動物治療を必要とせず、3)従来の免疫標識として、共標識と互換性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
筋線維壊死は、正常な筋肉の外傷性運動の一般的な結果である。それは局所的な筋肉前駆者の強力な再生能力によって十分に補償される。しかし、MDのようないくつかの筋肉の状態では、衛星細胞の再生能力は慢性ミネクロシスおよび過剰な線維化によって損なわれる。最近の知見は、筋線維が壊死の調節形態である壊死によって死ぬことを示している。より具体的には、壊性の阻害は、DMD?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、トランスラマッスル・プログラムとの協会フランセーズ・コントレ・レ・ミオパシーによってサポートされました。著者たちは、ペルラ・レイエス=フェルナンデス博士とマシュー・ボロク博士が原稿を注意深く読んでくれたことに感謝している。
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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