Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies
Summary
Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.
Abstract
De necrose van spiervezels (myonecrose) speelt een centrale rol in de pathogenese van verschillende spieraandoeningen, waaronder spier dystrofieën. Therapeutische opties aanpakken van de oorzaken van spierdystrofie pathogenese worden verwacht te verlichten spier degeneratie. Daarom is een methode nodig om de mate van celdood in spier biopsieën te testen en te kwantificeren. Conventionele methoden om myofiber degeneratie in situ te observeren zijn ofwel slecht kwantitatief of vertrouwen op de injectie van vitale kleurstoffen. In dit artikel wordt een immunofluorescentie protocol beschreven dat necrotische myovezels vlekken door de opname van immunoglobuline G (IgG) door myovezels te targeten. De IgG-opnamemethode is gebaseerd op celkenmerken die de necrotische ondergang karakteriseren, waaronder 1) het verlies van de integriteit van het plasma membraan met de afgifte van schade-geassocieerde moleculaire patronen en 2) de opname van plasmatische eiwitten. De co-immuunetikettering van myovezels, extracellulaire matrix proteïnen en muis IgG maakt een heldere en eenvoudige identificatie van myovezels met necrotisch lot mogelijk. Deze eenvoudige methode is geschikt voor kwantitatieve analyse en toepasbaar op alle soorten, inclusief menselijke monsters, en vereist geen injectie van vitale kleurstof. De kleuring van necrotische myovezels door IgG-opname kan ook worden gekoppeld aan andere co-immunolabeling.
Introduction
Striated skeletspieren bestaan voornamelijk uit spiervezels (myofibers), die verantwoordelijk zijn voor de kenmerkende vrijwillige contractiele functie. Deze cellen zijn multinucleated, post-mitotische structuren die mechanische stress die optreedt tijdens de contractie ondersteunen. Structurele stabiliteit van het myofiber membraan (sarcolemma) en de extracellulaire matrix zijn cruciaal voor weefselhomeostase. Satelliet cellen bestaan uit de belangrijkste spier voorloper populatie in volwassen skeletspieren en bestaan in een rusttoestand in gezonde spieren. Na de dood van myofiber wordt de spier regeneratie ondersteund door satelliet cellen na een myogeen programma dat satellietcel activatie, proliferatie, differentiatie en fusie inhoudt om uiteindelijk nieuwe meerkernige myovezels te vormen.
Myofiber ondergang kan optreden in meerdere spieraandoeningen, met inbegrip van mechanisch trauma, ischemie-reperfusie verwondingen, of spier dystrofieën, en het wordt geassocieerd met de necrotische morfologie van dode cellen1,2. Necrotische dood wordt gekenmerkt door de snelle permeabiliteit van het plasma membraan en het vrijkomen van celinhoud in het extracellulaire compartiment3. Het kan voortvloeien uit een niet-gereglementeerde proces waarbij geen goede cel signalering (dat wil zeggen, toevallige necrose), of een georkestreerde intracellulaire traject (dat wil zeggen, gereguleerde necrose). In myofibers, zowel gereguleerde4 en niet-gereglementeerde5 processen kunnen leiden tot necrose. Een typisch gevolg van myonecrose is het vrijkomen van schade-geassocieerde molecuul patronen, het activeren van een krachtige ontstekingsreactie6. De aanwezigheid van macrofagen wordt waargenomen bij ongeveer 48 uur en 72 h na letsel7. Naast hun rol in de klaring van necrotisch puin, zijn ze ook belangrijk in de spier regeneratie van8,9.
Musculaire dystrofieën (MDs) zijn een heterogene groep van pathologieën die vaak het gevolg zijn van een defect in de sarcolemma-structuur. Duchenne spierdystrofie (DMD) is een juveniele X-gebonden ziekte van ongeveer 1 op elke 3.500 mannelijke geboorten wereldwijd10, en wordt veroorzaakt door de afwezigheid van Dystrofine expressie bij de sarcolemma. Chronische degeneratie van het spierweefsel in DMD jongens leidt tot extreme spierzwakte en vroege sterfte. Ontsteking als gevolg van necrotische dood verbetert de cytotoxiciteit, en bevordert spier fibrose en het verlies van spierfunctie11,12. Behandelingen die momenteel in klinische studies gericht zijn op de wortels van spier degeneratieve aandoeningen, zoals gentherapie, worden verwacht om myonecrose te verlichten. Daarom zijn eenvoudige technieken nodig om spier degeneratie nauwkeurig te kwantificeren.
Verschillende methoden worden routinematig gebruikt voor het bewaken van myofiber verlies in vivo. De meting van de enzymatische activiteit van creatine kinase (CK) in het bloed maakt een betrouwbare kwantificering van aanhoudende necrose in spier-en hart weefsels mogelijk. In situ is de kleuring van bij en eosine (H & E) de meest populaire methode die momenteel wordt gebruikt voor de diagnose om de remodelleer van degeneratie-regeneratie te beoordelen. De moleculaire basis van de H & E-etikettering van dode cellen blijft echter onduidelijk. Bovendien zijn kleurwijzigingen die suggereren dat de dood van myofiber in H & E-kleuring relatief subtiel is en niet betrouwbaar en reproduceerbare kwantificering vergemakkelijken. Methoden die DNA-fragmentatie onthullen, zoals de terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end labelling (TUNEL), onvolkomen label necrotische dood3. Ze zijn ook slecht aangepast om de dood van syncytiële cellen zoals myofibers te monitoren. De injectie van vitale kleurstoffen, zoals Evan’s Blue Dye (EBD), vertegenwoordigt een nuttig alternatief voor het beoordelen van myovezels die de integriteit van sarcolemma hebben verloren, maar is niet noodzakelijkerwijs handig in sommige experimentele protocollen. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van EBD in bloedmonsters kan invloed hebben op de resultaten van CK metingen, een colorimetrische assay. Bovendien maakt intracellulaire opname van EBD co-immunolabeling uitdagend. Daarom is een alternatieve methode voor directe etikettering van myofibers die necrose ondergaat van belang.
Het werkingsmechanisme van vitale kleurstoffen berust op het verlies van de integriteit van het plasma membraan in necrotische myovezels en de passieve opname van de geïnjecteerde kleurstof. Evenzo, necrotische myofibers opname bloed eiwitten zoals albumine, waarvoor EBD heeft een sterke affiniteit13,14, immunoglobuline G (IgG), en IgM15. De abnormale aanwezigheid van bloed eiwitten binnen myovezels vertegenwoordigt daarom handige markers voor myonecrose in situ. Kleuring deze eiwitten kunnen een alternatief zijn voor het gebruik van vitale kleurstoffen.
Door gebruik te maken van IgG-opname als een marker van myonecrose in situ, wordt dit protocol gebruikt om de spier degeneratie in de tibialis voorste (TA) van de MDX-Dystrofine-deficiënte muizen te beoordelen. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve technieken: 1) het is reproduceerbaar en eenvoudig in de uitvoering ervan; 2) het vereist geen dier behandeling voorafgaand aan de spier inzameling, zoals de injectie van circulerende vitale kleurstoffen, en 3) als elke conventionele immunolabeling, het is compatibel met co-labeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber necrose is een gemeenschappelijk gevolg van traumatische oefening in normale spieren. Het is goed gecompenseerd door een krachtige regeneratieve capaciteit van de lokale spier voor ouders. Echter, in verschillende spieraandoeningen zoals in MDs, de regeneratieve capaciteit van de satelliet cellen wordt aangetast door chronische myonecrose en overmatige fibrose. Recente bevindingen tonen aan dat spiervezels kunnen sterven door necroptose, een gereguleerde vorm van necrose. Meer in het bijzonder kan de remming van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Association Française contre les Myopathies met het Translamuscle programma. De auteurs bedanken Dr. Perla Reyes-Fernandez en Dr. Matthew Borok voor hun zorgvuldige lezing van het manuscript.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
