Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien
Summary
Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.
Abstract
Die Nekrose der Muskelfasern (Myonecrosis) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese mehrerer Muskelerkrankungen, einschließlich Muskeldystrophien. Therapeutische Optionen zur Bekämpfung der Ursachen der Muskeldystrophie Pathogenese werden erwartet, um Muskeldegeneration zu lindern. Daher ist eine Methode erforderlich, um das Ausmaß des Zelltodes in Muskelbiopsien zu asse- und zu quantifizieren. Herkömmliche Methoden zur Beobachtung der Myofiberdegeneration vor Ort sind entweder schlecht quantitativ oder verlassen sich auf die Injektion lebenswichtiger Farbstoffe. In diesem Artikel wird ein Immunfluoreszenzprotokoll beschrieben, das nekrotische Myofiber durch gezielte Immunglobulin-G-Aufnahme (IgG) durch Myofiber stutzt. Die IgG-Aufnahmemethode basiert auf Zellmerkmalen, die den nekrotischen Untergang charakterisieren, einschließlich 1) des Verlusts der Plasmamembranintegrität mit der Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern und 2) der Aufnahme von Plasmaproteinen. In murinen Querschnitten ermöglicht die Co-Immunolabelling von Myofibiden, extrazellulären Matrixproteinen und Maus-IgG eine saubere und unkomplizierte Identifizierung von Myofiberen mit nekrotischem Schicksal. Diese einfache Methode eignet sich für die quantitative Analyse und gilt für alle Arten, einschließlich menschlicher Proben, und erfordert keine Injektion von Vitalfarbstoff. Die Färbung nekrotischer Myofiber durch IgG-Aufnahme kann auch mit anderen Co-Immunolabelling gekoppelt werden.
Introduction
Gestreifter Skelettmuskel besteht hauptsächlich aus Muskelfasern (Myofiber), die für die charakteristische freiwillige kontraktile Funktion verantwortlich sind. Diese Zellen sind multinukleierte, post-mitotische Strukturen, die mechanische Beanspruchung unterstützen, die während der Kontraktion auftritt. Die strukturelle Stabilität der Myofibermembran (Sarcolemma) und ihrer extrazellulären Matrix sind entscheidend für die Gewebehomöostase. Satellitenzellen bilden die Hauptmuskelvorläuferpopulation in reifen Skelettmuskeln und existieren in einem ruhestillen Zustand in gesunden Muskeln. Nach dem Myofibertod wird die Muskelregeneration von Satellitenzellen nach einem myogenen Programm unterstützt, das die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung und Fusion von Satellitenzellen umfasst, um schließlich neue multinukleierte Myofiber zu bilden.
Myofiber-Tod kann bei mehreren Muskelerkrankungen auftreten, einschließlich mechanischer Traumata, Ischämie-Reperfusionsverletzungen oder Muskeldystrophien, und es ist mit der nekrotischen Morphologie der abgestorbenen Zellen1,2verbunden. Der nekrotische Tod ist durch die schnelle Durchlässigkeit der Plasmamembran und die Freisetzung des Zellgehalts im extrazellulären Fach3gekennzeichnet. Es kann entweder aus einem unregulierten Prozess ohne richtige Zellsignalisierung (d. h. versehentliche Nekrose) oder einem orchestrierten intrazellulären Weg (d. h. regulierter Nekrose) resultieren. Bei Myofiberen können sowohl geregelte4 als auch unregulierte5 Prozesse zu Nekrose führen. Eine typische Folge der Myonekinismus ist die Freisetzung von schadensassoziierten Molekülmustern, die eine starke Entzündungsreaktion aktivieren6. Das Vorhandensein von Makrophagen wird bei etwa 48 h und 72 h nach Verletzung7beobachtet. Neben ihrer Rolle bei der Clearance von nekrotischen Ablagerungen sind sie auch wichtig bei der Muskelregeneration8,9.
Muskeldystrophien (MDs) sind eine heterogene Gruppe von Pathologien, die oft auf einen Defekt in der Sarcolemma-Struktur zurückzuführen sind. Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine juvenile X-verknüpfte Krankheit, die etwa 1 von 3.500 männlichen Geburten weltweit10betrifft, und sie wird durch das Fehlen von Dystrophin-Expression am Sarcolemma verursacht. Chronische Degeneration des Muskelgewebes bei DMD-Jungen führt zu extremer Muskelschwäche und früher Sterblichkeit. Entzündungen, die durch den nekrotischen Tod entstehen, verbessern die Zytotoxizität und fördern die Muskelfibrose und den Verlust der Muskelfunktion11,12. Behandlungen, die sich derzeit in klinischen Studien mit den Wurzeln von Muskeldegenerativen Erkrankungen, wie gentherapie, richten, sollen die Myonekinz lindern. Daher sind einfache Techniken zur genauen Quantifizierung der Muskeldegeneration erforderlich.
Mehrere Methoden werden routinemäßig verwendet, um Myofiber Verlust in vivo zu überwachen. Die Messung der enzymatischen Aktivität der Kreatinkinase (CK) im Blut ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung der fortlaufenden Nekrose in Muskel- und Herzgeweben. In situ ist die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) die beliebteste Methode, die derzeit in der Diagnose zur Beurteilung der Degeneration-Regenerations-Remodellierung verwendet wird. Die molekulare Grundlage der H&E-Kennzeichnung abgestorbener Zellen bleibt jedoch unklar. Darüber hinaus sind Farbmodifikationen, die auf den Myofibertod bei der H&E-Färbung hindeuten, relativ subtil und ermöglichen keine zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierung. Methoden, die DNA-Fragmentierung offenbaren, wie die Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase dUTP-Nick-End-Etikettierung (TUNEL), unvollkommen kennzeichnen nekrotischen Tod3. Sie sind auch schlecht angepasst, um den Tod von Synzytialzellen wie Myofibers zu überwachen. Die Injektion von Vitalfarbstoffen, wie Evans Blaufarbstoff (EBD), stellt eine nützliche Alternative zur Beurteilung von Myofiwanen dar, die die Integrität von Sarcolemma verloren haben, aber in einigen experimentellen Protokollen nicht unbedingt bequem sind. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von EBD in Blutproben die Ergebnisse von CK-Messungen beeinflussen, ein kolorimetrischer Test. Darüber hinaus stellt die intrazelluläre Aufnahme von EBD die Co-Immunolabelling-Herausforderung dar. Daher ist eine alternative Methode, die eine direkte Kennzeichnung von Myofiberen ermöglicht, die sich einer Nekrose unterziehen, von Interesse.
Der Wirkmechanismus lebenswichtiger Farbstoffe beruht auf dem Verlust der Plasmamembranintegrität bei nekrotischen Myofikern und der passiven Aufnahme des injizierten Farbstoffs. In ähnlicher Weise nehmen nekrotische Myofiber Blutproteine wie Albumin auf, für die EBD eine starke Affinität hat13,14, Immunglobulin G (IgG) und IgM15. Das abnormale Vorhandensein von Blutproteinen in Myofiberstelltstelltstelltstellt daher praktische Marker für Myonecrosis vor Ort. Die Färbung dieser Proteine kann eine Alternative für die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen sein.
Durch die Verwendung der IgG-Aufnahme als Marker der Myonekinkis in situ wird dieses Protokoll verwendet, um die Muskeldegeneration im tibialis anterior (TA) von mdx Dystrophin-mangelhaften Mäusen zu bewerten. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber alternativen Techniken: 1) sie ist reproduzierbar und einfach in ihrer Ausführung; 2) es erfordert keine Tierbehandlung vor der Muskelentnahme, wie die Injektion von zirkulierenden Vitalfarbstoffen, und 3) wie jede herkömmliche Immunolabelling, ist es mit der Ko-Kennzeichnung kompatibel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber-Nekrose ist eine häufige Folge traumatischer Bewegung in normalen Muskeln. Es wird durch eine starke Regenerationsfähigkeit der lokalen Muskelvorläufer gut kompensiert. Bei mehreren Muskelerkrankungen, wie z. B. bei MDs, wird die Regenerationsfähigkeit von Satellitenzellen jedoch durch chronische Myonekrose und übermäßige Fibrose beeinträchtigt. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Muskelfasern durch Nekkrotose, eine regulierte Form der Nekrose, absterben können. Genauer gesagt, die Hemmung der Nekrotose ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Association Franéaise contre les Myopathies mit dem Translamuscle-Programm unterstützt. Die Autoren danken Dr. Perla Reyes-Fernandez und Dr. Matthew Borok für die sorgfältige Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
