मांसपेशी बायोप्सी में इम्यूनोलेबलिंग मायोफाइबर डिजनरेशन
Summary
यहां वर्णित मांसपेशियों क्रायोसेक्शन में परिगलित मायोफिकर्स के प्रत्यक्ष इम्यूनोलेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है। नेक्रोटिक कोशिकाएं सीरम प्रोटीन के लिए पारगम्य हैं, जिनमें इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) शामिल हैं। मायोफिकर्स द्वारा आईजीजी के तेज होने का खुलासा करने से मांसपेशियों की स्थिति की परवाह किए बिना परिगलन से गुजरने वाले मायोफिकर्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति होती है।
Abstract
मांसपेशियों के रेशों (मायोन्क्रोसिस) का परिगलन मांसपेशियों की डिस्ट्रोफ्रोथ सहित कई मांसपेशियों की स्थितियों के रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी रोगजनन के कारणों को संबोधित करने वाले चिकित्सीय विकल्पमांसपेशियों के पतन को कम करने की उम्मीद है। इसलिए, मांसपेशियों की बायोप्सी में कोशिका मृत्यु की सीमा को परखने और निर्धारित करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है। पारंपरिक तरीकों सीटू में मायोफाइबर पतन का पालन करने के लिए या तो खराब मात्रात्मक है या महत्वपूर्ण रंगों के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं । इस लेख में, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है कि माओफिकर्स द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) तेज को लक्षित करके दाग परिगलित मायोफिकर्स। आईजीजी तेज विधि कोशिका सुविधाओं पर आधारित है, जिसमें 1) नुकसान से जुड़े आणविक पैटर्न और 2) प्लाजमैटिक प्रोटीन की रिहाई के साथ प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का नुकसान शामिल है। मूत्र क्रॉस-सेक्शन में, माओफीयर्स, एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन और माउस आईजीजी की सह-इम्यूनोलेबलिंग परिगलित भाग्य के साथ मायोफिकर्स की स्वच्छ और सीधी पहचान की अनुमति देती है। यह सरल विधि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त है और मानव नमूनों सहित सभी प्रजातियों पर लागू होती है, और इसके लिए महत्वपूर्ण रंग के इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है। आईजीजी तेज द्वारा परिगलित मायोफिकर्स के धुंधला होने को अन्य सह-इम्यूनोलेबलिंग के साथ भी जोड़ा जा सकता है।
Introduction
स्ट्राइएट कंकाल की मांसपेशी में मुख्य रूप से मांसपेशियों के रेशे (मायोफिकर्स) होते हैं, जो विशेषता स्वैच्छिक अनुबंध समारोह के लिए जिम्मेदार होते हैं। ये कोशिकाएं बहुआयामी, पोस्ट-माइटोटिक संरचनाएं हैं जो संकुचन के दौरान होने वाले यांत्रिक तनाव का समर्थन करती हैं। मायोफाइबर झिल्ली (सरकोलम्मा) और इसके बाह्य मेट्रिक्स की संरचनात्मक स्थिरता ऊतक होमोस्टोसिस के लिए महत्वपूर्ण है। उपग्रह कोशिकाओं परिपक्व कंकाल मांसपेशियों में मुख्य मांसपेशी जनक आबादी शामिल है और स्वस्थ मांसपेशियों में एक शांत राज्य में मौजूद हैं । मायोफाइबर मृत्यु के बाद, मांसपेशियों के उत्थान को एक मायोजेनिक कार्यक्रम के बाद उपग्रह कोशिकाओं द्वारा समर्थित किया जाता है जिसमें उपग्रह कोशिका सक्रियण, प्रसार, भेदभाव और संलयन शामिल है ताकि अंततः नए बहुआयामी मायोफिकर्स बन सके।
मायोफाइबर निधन यांत्रिक आघात, इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोटों, या मांसपेशियों की डिस्ट्रोफ्रोथ सहित कई मांसपेशियों की स्थितियों में हो सकता है, और यह मृत कोशिकाओं1,2के परिगलित आकृति विज्ञान से जुड़ा हुआ है। परिगलित मृत्यु प्लाज्मा झिल्ली की तेजी से सामर्थ्य और बाह्य डिब्बे3में कोशिका सामग्री को छोड़ने की विशेषता है। यह या तो एक अनियमित प्रक्रिया से परिणाम दे सकता है जिसमें कोई उचित सेल सिग्नलिंग (यानी, आकस्मिक परिगलन), या एक आर्केस्ट्रा इंट्रासेलुलर मार्ग (यानी, विनियमित परिगलन) शामिल है। मायोफिकर्स में, विनियमित4 और अनियमित5 प्रक्रियाएं दोनों परिगलन का कारण बन सकती हैं। myonecrosis का एक विशिष्ट परिणाम क्षति से जुड़े अणु पैटर्न की रिहाई है, एक शक्तिशाली भड़काऊ प्रतिक्रिया6को सक्रिय । 7चोटके बाद लगभग 48 घंटे और 72 घंटे में मैक्रोफेज की उपस्थिति देखी जाती है । परिगलित मलबे की मंजूरी में उनकी भूमिका के अलावा, वेमांसपेशियोंके उत्थान 8,9में भी महत्वपूर्ण हैं ।
मस्कुलर डिस्ट्रोफिक (एमडी) विकृतियों का एक विषम समूह है जो अक्सर सरकोलमसंरचना में दोष से परिणाम देता है। ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक किशोर एक्स-लिंक्ड रोग है जो दुनिया भर मेंहर3,500 पुरुष जन्मों में से लगभग 1 को प्रभावित करता है, और यह सरकोलेमा में डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति के अभाव के कारण होता है। डीएमडी लड़कों में मांसपेशियों के ऊतकों का पुराना पतन अत्यधिक मांसपेशियों की कमजोरी और प्रारंभिक मृत्यु दर की ओर जाता है। परिगलित मृत्यु के परिणामस्वरूप सूजन साइटोटॉक्सिकिसिटी को बढ़ाती है, और मांसपेशियों के फाइब्रोसिस और मांसपेशियों के कार्य11,12के नुकसान को बढ़ावा देती है। वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में उपचार ऐसे जीन थेरेपी के रूप में मांसपेशियों अपक्षयी विकारों की जड़ों को लक्षित, myonecrosis कम करने की उम्मीद कर रहे हैं । इसलिए मांसपेशियों के पतन की सटीक मात्रा निर्धारित करने के लिए सरल तकनीकों की आवश्यकता है।
वीवो में मायोफाइबर नुकसान की निगरानी के लिए नियमित रूप से कई तरीकों का उपयोग किया जाता है। रक्त में क्रिएटिन किनेज (सीके) की एंजाइमैटिक गतिविधि की माप मांसपेशियों और दिल के ऊतकों में चल रहे परिगलन के विश्वसनीय मात्राकरण की अनुमति देती है। सीटू में, हीमेटॉक्सीलिन और ईसिन (एच एंड ई) धुंधला सबसे लोकप्रिय विधि है जो वर्तमान में निदान में उपयोग की जाने वाली सबसे लोकप्रिय विधि है जो पतन-पुनर्जनन पुनर्मॉडलिंग का आकलन करने के लिए है। हालांकि, मृत कोशिकाओं की एच एंड ई लेबलिंग का आणविक आधार अस्पष्ट बना हुआ है। इसके अलावा, एच एंड ई धुंधला में मायोफाइबर मौत का सुझाव देने वाले रंग संशोधन अपेक्षाकृत सूक्ष्म हैं और विश्वसनीय और प्रजनन योग्य मात्राकी की सुविधा नहीं देते हैं। डीएनए विखंडन का खुलासा करने वाले तरीके, जैसे टर्मिनल डिऑक्सीन्यूक्लियोटिल ट्रांसफरेज़ डीयूटीपी निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल), एपूरी तरह से परिगलित मृत्यु3लेबल। उन्हें मायोफ़ियर्स जैसी सिंकिल कोशिकाओं की मौत की निगरानी करने के लिए खराब रूप से अनुकूलित किया जाता है। इवान के ब्लू डाये (ईबीडी) जैसे महत्वपूर्ण रंगों का इंजेक्शन, मायोफिकर्स का आकलन करने के लिए एक उपयोगी विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है जो सरकोलेमा की अखंडता खो चुके हैं, लेकिन कुछ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में जरूरी सुविधाजनक नहीं है। उदाहरण के लिए, रक्त के नमूनों में ईबीडी की उपस्थिति सीके माप, एक रंगीन परख के परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसके अलावा, ईबीडी का इंट्रासेलर तेज सह-इम्यूनोलेबलिंग को चुनौतीपूर्ण बनाता है। इसलिए, परिगलन के दौर से गुजर रहे मायोफिकर्स की सीधी लेबलिंग की अनुमति देने वाली एक वैकल्पिक विधि ब्याज की है ।
महत्वपूर्ण रंगों की कार्रवाई का तंत्र परिगलित मायोफिकर्स में प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान और इंजेक्शन डाइज के निष्क्रिय तेज पर निर्भर करता है। इसी तरह, नेक्रोटिक मायोटिकर्स एल्बुमिन जैसे रक्त प्रोटीन को तेज करते हैं, जिसके लिए ईबीडी में एक मजबूत आत्मीयता13,14,इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी), और आईजीएम15है। इसलिए मायोफिकर्स के भीतर रक्त प्रोटीन की असामान्य उपस्थिति सीटू में मायोनक्रोसिस के लिए सुविधाजनक मार्कर का प्रतिनिधित्व करती है। इन प्रोटीन धुंधला महत्वपूर्ण रंगों के उपयोग के लिए एक विकल्प हो सकता है।
सीटू में मायोनेक्रोसिस के मार्कर के रूप में आईजीजी तेज का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एमडीएक्स डिस्ट्रोफिन-कमी वाले चूहों के टिबिलिस पूर्वकाल (टीए) में मांसपेशियों के पतन का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह विधि वैकल्पिक तकनीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करती है: 1) यह इसके निष्पादन में प्रजनन योग्य और सरल है; 2) यह मांसपेशियों के संग्रह से पहले किसी भी पशु उपचार की आवश्यकता नहीं है, जैसे महत्वपूर्ण रंगों परिसंचारी के इंजेक्शन के रूप में, और 3) किसी भी पारंपरिक इम्यूनोलेबलिंग के रूप में, यह सह लेबलिंग के साथ संगत है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मायोफाइबर परिगलन सामान्य मांसपेशियों में दर्दनाक व्यायाम का एक आम परिणाम है। यह स्थानीय मांसपेशियों के जनकों की एक शक्तिशाली पुनर्योजी क्षमता द्वारा अच्छी तरह से मुआवजा दिया जाता है। हालांकि, एमडी ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ट्रांसलामांसपेशी कार्यक्रम के साथ एसोसिएशन फ्रैंकोइस कॉन्ट्रे लेस मायोपैथी द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक पढ़ने के लिए डॉ पेरला रेयेस-फर्नांडीज और डॉ मैथ्यू बोरोक का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
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