Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon
Summary
Burada açıklanan kas kriyokesitlerinde nekrotik miyofiberlerin doğrudan immünolabelling için bir protokoldür. Nekrotik hücreler immünglobulin G (IgG) dahil olmak üzere serum proteinlerine geçirilebilir. Miyofiberler tarafından IgG alımının ortaya çıkması, kas durumuna bakılmaksızın nekroz geçiren miyoliflerin tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak sağlar.
Abstract
Kas liflerinin nekrozu (mionekrozisi) kas distrofileri de dahil olmak üzere çeşitli kas hastalıklarının patogenezinde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu hafifletmek için kas distrofi patogenezi nedenleri ele terapötik seçenekler bekleniyor. Bu nedenle kas biyopsilerinde hücre ölümünün derecesini hesaplamak ve hesaplamak için bir yöntem gereklidir. Yerinde miyofiber dejenerasyongözlemlemek için geleneksel yöntemler ya kötü kantitatif ya da hayati boyaların enjeksiyonu güveniyor. Bu makalede, immünofloresan protokolü, miyolifler tarafından immünglobulin G (IgG) alımını hedefleyerek nekrotik miyoliflerin lekelerinin nekrotik miyokerruz lar olduğu tanımlanmıştır. IgG alım yöntemi nekrotik ölümü karakterize eden hücre özelliklerine dayanır, dahil 1) hasara bağlı moleküler desenlerin salınımı ile plazma membran bütünlüğünün kaybı ve 2) plazmatik proteinlerin alımı. Murine kesitlerinde, miyoliflerin, hücre dışı matriks proteinlerinin ve fare IgG’nin birlikte immünetiketlemesi miyoliflerin nekrotik kaderle temiz ve anlaşılır bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu basit yöntem kantitatif analiz için uygundur ve insan örnekleri de dahil olmak üzere tüm türler için geçerlidir ve hayati boya enjeksiyonu gerektirmez. IgG alımı ile nekrotik miyofiberlerin boyanması da diğer co-immünlabelling ile eşleşebilir.
Introduction
Striated iskelet kası esas olarak karakteristik gönüllü kontraktil fonksiyon sorumludur kas lifleri (miyofiberler), oluşur. Bu hücreler daralma sırasında meydana gelen mekanik stresi destekleyen çok çekirdekli, post-mitotik yapılardır. Miyofiber membranın yapısal stabilitesi (sarkolemma) ve hücre dışı matriks doku homeostazisi için çok önemlidir. Uydu hücreleri olgun iskelet kası ana kas atası popülasyonunu oluşturur ve sağlıklı kaslarda kin halinde bulunur. Miyofiber ölümden sonra, kas rejenerasyonuydu hücre aktivasyonu içeren bir miyojenik programı takip uydu hücreleri tarafından desteklenir, çoğalma, farklılaşma, ve füzyon sonuçta yeni multinükleli miyofonlar oluşturmak için.
Miyofik ölümü birden fazla kas koşullarında oluşabilir, mekanik travma da dahil olmak üzere, iskemi-reperfüzyon yaralanmaları, veya kas distrofiler, ve ölü hücrelerin nekrotik morfolojisi ile ilişkili1,2. Nekrotik ölüm plazma zarının hızlı geçirgenliği ve hücre dışı kompartmanda hücre içeriğinin serbest bırakılması ile karakterizedir3. Uygun bir hücre sinyali (yani kazara nekroz) içermeyen düzensiz bir süreç ya da düzenlenmiş bir hücre içi yol (yani, düzenlenmiş nekroz) ile sonuçlanabilir. Miyofiberlerde hem düzenlenmiş4 hem de düzensiz5 proses nekrozuna yol açabilir. Mionekrozun tipik bir sonucu, hasarla ilişkili molekül desenlerinin serbest bırakılmasıdır, güçlü bir inflamatuaryanıtıaktive 6. Makrofajların varlığı yaklaşık 48 h ve 72 h yaralanma dan sonra gözlenmektedir7. Nekrotik enkaz temizliği ndeki rollerinin yanı sıra, kas rejenerasyonu8,9da önemlidir.
Kas distrofileri (MDs) genellikle sarkolemma yapısında bir kusur sonucu patolojiler heterojen bir gruptur. Duchenne musküler distrofi (DMD)dünyaçapında her 3.500 erkek doğumdan yaklaşık 1’ini etkileyen x bağlantılı bir hastalıktır ve sarkolemmada distrofin ekspresyonunun olmamasından kaynaklanır. DMD erkek çocuklarda kas dokusunun kronik dejenerasyonu aşırı kas güçsüzlüğü ve erken mortaliteye yol açar. Nekrotik ölüm sonucu inflamasyon sitotoksisite artırır, ve kas fibrozis ve kas fonksiyonu kaybı teşvik11,12. Gen tedavisi gibi kas dejeneratif bozukluklarının köklerini hedefleyen klinik çalışmalarda şu anda tedavilerin mionekroziyi hafifletmesi beklenmektedir. Bu nedenle kas dejenerasyonu doğru bir şekilde ölçmek için basit tekniklere ihtiyaç vardır.
Çeşitli yöntemler rutin in vivo miyofiber kaybını izlemek için kullanılır. Kandaki kreatin kizazın (CK) enzimatik aktivitesinin ölçülmesi kas ve kalp dokularında devam eden nekrozun güvenilir bir şekilde ölçülmesine olanak sağlar. Yerinde, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama şu anda dejenerasyon-rejenerasyon remodelling değerlendirmek için tanı kullanılan en popüler yöntemdir. Ancak, ölü hücrelerin H & E etiketleme moleküler temeli belirsizliğini koruyor. Ayrıca, H & E boyama miyofiber ölüm düşündüren renk modifikasyonları nispeten ince ve güvenilir ve tekrarlanabilir nicelleştirme kolaylaştırmak değildir. Terminal deoksinükleotidyl transferaz dUTP nick uç etiketleme (TUNEL), kusurlu etiket nekrotik ölüm3gibi DNA parçalanması ortaya çıkaran yöntemler. Onlar da kötü miyofibers gibi senytial hücrelerin ölümünü izlemek için adapte edilmiştir. Evan’ın mavi boya (EBD) gibi hayati boyaların enjeksiyonu, sarkolemmanın bütünlüğünü kaybetmiş miyolifleri değerlendirmek için yararlı bir alternatiftir, ancak bazı deneysel protokollerde mutlaka uygun değildir. Örneğin, kan örneklerinde EBD varlığı CK ölçümleri, bir kolorimetrik tahsin sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca, EBD hücre içi alımı co-immunolabelling zorlu hale getirir. Bu nedenle, nekroz geçiren miyofiberlerin doğrudan etiketlenmesine olanak tanıyan alternatif bir yöntem ilgi çekicidir.
Hayati boyaların etki mekanizması nekrotik miyofiberlerde plazma membran bütünlüğünün kaybına ve enjekte edilen boyanın pasif alımına dayanır. Benzer şekilde, nekrotik miyofiberler albümin gibi kan proteinlerini alımı, hangi EBD güçlü bir yakınlık vardır13,14, immünglobulin G (IgG), ve IgM15. Miyolifler içinde kan proteinlerinin anormal varlığı bu nedenle yerinde mionekroz için uygun belirteçleri temsil eder. Bu proteinlerin boyanması hayati boyaların kullanımı için bir alternatif olabilir.
IgG alımını yerinde mionekrozun belirteci olarak kullanarak, bu protokol mdx distrofin eksikliği olan farelerin tibialis anterior (TA) kas dejenerasyonu değerlendirmek için kullanılır. Bu yöntem alternatif teknikler üzerinde önemli avantajlar sunar: 1) çoğaltılabilir ve yürütülmesi basit; 2) bu kas toplama öncesinde herhangi bir hayvan tedavisi gerektirmez, hayati boyalar dolaşan enjeksiyon gibi, ve 3) herhangi bir konvansiyonel immünetiketleme olarak, bu co-etiketleme ile uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miyofiber nekrozu normal kaslarda travmatik egzersizin yaygın bir sonucudur. Bu iyi yerel kas atalarının güçlü bir rejeneratif kapasitesi ile telafi edilir. Ancak, MDs gibi çeşitli kas koşullarında, uydu hücrelerinin rejeneratif kapasitesi kronik mionekroz isi ve aşırı fibrozis tarafından tehlikeye. Son bulgular kas liflerinin nekrozun düzenlenmiş bir formu olan nekroz ile ölebileceğini göstermektedir. Daha spesifik olarak, nekroz inhibisyonu DMD tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi haline gelebi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Translamuscle programı ile Dernek Française contre les Myopathies tarafından desteklenmiştir. Yazarlar dr Perla Reyes-Fernandez ve Dr Matthew Borok onların el yazması dikkatli okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
