وضع العلامات علي الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية باستخدام Perfusion القلب مع المثبت
Summary
يصف هذا المقال بروتوكولا سريعا لوصف الاوعيه الدموية في الأسماك تيليست عن طريق التروية القلبية من المخفف في المثبت ، وذلك باستخدام الميداكا (اوريزيز لا تيبس) كنموذج والتركيز علي الدماغ والانسجه النخامية.
Abstract
الاوعيه الدموية العصبية جميع الانسجه في الفقاريات ، مما يتيح البقاء علي قيد الحياة من خلال توفير المواد الغذائية اللازمة ، والأكسجين ، والإشارات الهرمونية. وهي واحده من الاجهزه الاولي التي تبدا العمل اثناء التنمية. أصبحت أليات تكوين الاوعيه الدموية موضوعا للاهتمام العلمي والسريري العالي. في البالغين ومع ذلك ، فانه من الصعب تصور الاوعيه الدموية في معظم الكائنات الحية بسبب توطينهم عميقا داخل الانسجه الأخرى. ومع ذلك ، لا يزال التصور من الاوعيه الدموية الهامه لعده دراسات مثل الغدد الصماء والبيولوجيا العصبية. في حين تم تطوير عده خطوط المحورة وراثيا في zebrafish ، مع الاوعيه الدموية تصور مباشره من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية ، لا توجد مثل هذه الاداات للأنواع الأخرى تيليوست. باستخدام الميداكا (اوريزيراس لا تيبس) كنموذج ، والبروتوكول الحالي يقدم تقنيه سريعة ومباشره لتسميه الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية من خلال الأداء المثالي عن طريق القلب مع المثبتة التي تحتوي علي الصورة. يسمح هذا البروتوكول بتحسين فهمنا لكيفيه تفاعل المخ والخلايا النخامية مع الاوعيه الدموية في الانسجه الكاملة أو شرائح الانسجه السميكة.
Introduction
تلعب الاوعيه الدموية جزءا أساسيا من الجسم الفقاري لأنها توفر العناصر الغذائية الضرورية والأكسجين والإشارات الهرمونية لجميع الأعضاء. أيضا ، منذ اكتشاف مشاركتهم في تطوير السرطان1، وقد تلقوا الكثير من الاهتمام في البحوث السريرية. وعلي الرغم من ان عددا من المنشورات قد حققت في أليات التي تسمح بنمو الاوعيه الدموية والمستنقعات ، وتم تحديد عدد كبير من الجينات الهامه لتشكيلها2، لا يزال هناك الكثير مما ينبغي فهمه فيما يتعلق بالتفاعل بين الخلايا أو الانسجه والدم المتداول.
التصور من الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية مهم. الخلايا العصبية في الدماغ تتطلب إمدادات عاليه من الأكسجين والجلوكوز3, والغدة النخامية يحتوي علي ما يصل إلى ثمانيه أنواع الخلايا المنتجة للهرمونات الهامه التي تستخدم تدفق الدم لتلقي اشاره من الدماغ وإرسال الهرمونات الخاصة بهم إلى مختلف الاجهزه الطرفية4,5. بينما في الثدييات ، ونظام البوابة في قاعده تحت المهاد اسمه الفضيلة وسيط ، يربط الدماغ والغدة النخامية6، مثل هذا الجسر الدم واضحة لم يوصف في الأسماك تيليوست. في الواقع ، في teleosts ، preoptico-طائي الخلايا العصبية مباشره المشروع محاور في بارس العصبي من الغدة النخامية7 ومعظمها inعصبيه أنواع الخلايا الصماء المختلفة مباشره8،9. ومع ذلك ، فان بعض هذه الخلايا العصبية لها نهاياتها العصبية الموجودة في الفضاء الخارج ، في المنطقة القريبة من الشعيرات الدموية10. ولذلك ، فان الفرق بين الأسماك تيليوست والثدييات ليست واضحة جدا ، والعلاقة بين الاوعيه الدموية في الدم والدماغ والخلايا النخامية يتطلب المزيد من التحقيق في الأسماك تيليوست.
[زبرفيش] يتلقى, في كثير مظاهر, تشريحيا ووظيفيا قابل للمقارنة نظامه وعائية إلى أخرى فقاري أنواع11. وقد أصبح نموذج فقاري قويه للبحوث القلب والاوعيه الدموية في الغالب بفضل تطوير عده خطوط المحورة وراثيا حيث يتم تسميه مكونات نظام الاوعيه الدموية مع البروتينات الفلورية مراسل12. ومع ذلك ، قد يختلف تشريح نظام الدوران الدقيق بين الأنواع ، أو حتى بين شخصين ينتميان إلى نفس النوع. ولذلك ، فان التصور من الاوعيه الدموية قد تكون ذات فائده عاليه أيضا في الأنواع الأخرى تيليوست التي لا وجود لها أدوات التكوين.
وقد تم وصف العديد من التقنيات لتسميه الاوعيه الدموية في كل من الثدييات والتيليتات. وتشمل هذه التهجين في الموقع للجينات الاوعيه الدموية المحددة, تلطيخ الفوسفاتيز القلوية, تصوير الاوعيه الدقيقة, وحقن صبغ (للمراجعة انظر13). وقد استخدمت لأول مره لدراسة الدهون غشاء الحركية الجانبية والاحتفاظ بها في الطبقات الدهنية ويمكن ان تهاجر من خلال ذلك14,15,16. في الواقع ، يتكون جزيء من السلسلة الهيدروكربونية من سلسلتين من الهيدروكربونات والكروم. وفي حين ان السلاسل الهيدروكربونية تدمج في غشاء الخلية الدهنية للخلايا التي تلامسها ، فان الكروم لا يزال علي سطحه17. مره واحده في الغشاء ، وجزيئات الندية منتشر جانبيا داخل الطبقات الدهنية التي تساعد علي وصمه عار هياكل الاغشيه التي ليست علي اتصال مباشر مع حل الندية. التالي ، فان حقن محلول من خلال التروية القلبية ، سيقوم بتسميه جميع الخلايا البطانية في اتصال مع المركب الذي يسمح بالوسم المباشر للاوعيه الدموية. ويستخدم اليوم أيضا لأغراض تلطيخ أخرى ، مثل التصوير جزيء واحد ، وتعيين مصير ، وتتبع الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام ، وجود العديد من الفلوروبورس (مع أطوال موجية مختلفه من الانبعاثات) مما يسمح بالجمع مع التسميات الفلورية الأخرى ، والتاسيس ، فضلا عن الانتشار الجانبي لل ، يمكن ان يحدث في كل من الانسجه الحية والثابتة18، التاسعة عشره
الفورمالديهايد ، التي اكتشفها فرديناند بلوم في 1893 ، وقد استخدمت علي نطاق واسع في الوقت الحاضر كالمادة الكيميائية المفضلة لتثبيت الانسجه20،21. هو يبدي خصوصية واسعه ل كثير أهداف خلوية ويحافظ البنية خلوية22,23. كما انه يحفظ الخصائص الفلورية لمعظم الفلوروبيورس ، التالي يمكن استخدامها لتثبيت الكائنات المحورة وراثيا التي تستهدف الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل.
في هذه المخطوطة ، تم تكييف بروتوكول سابق تم تطويره لتسميه الاوعيه الدموية في نماذج الثدييات التجريبية الصغيرة24 لاستخدامه في الأسماك. الاجراء بأكمله يستغرق سوي بضع ساعات لأداء. فانه يوضح كيفيه حقنت حل مثبت من الفورمالديهايد التي تحتوي علي الندية في قلب السمكة من أجل التسمية مباشره جميع الاوعيه الدموية في الدماغ والغدة النخامية للنموذج الأسماك medaka. Medaka هي سمكه صغيره المياه العذبة الاصليه إلى اسيا ، وجدت في المقام الأول في اليابان. وهو كائن نموذج البحث مع مجموعه من الاداات الجزيئية والجينية المتاحة25. ولذلك ، فان تحديد الاوعيه الدموية في هذا النوع وكذلك في غيرها من شانه ان يسمح لتحسين فهمنا حول كيفيه تفاعل الدماغ والخلايا النخامية مع الاوعيه الدموية في الانسجه الكاملة أو شرائح الانسجه السميكة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت ترويه القلب مع الشركة سابقا لتسميه الاوعيه الدموية في العديد من الأنواع النموذجية24، بما في ذلك الأسماك تيليوست13.
كما يتم تسليمها مباشره إلى غشاء الخلية البطانية من قبل ترويه في الاوعيه الدموية ، فمن الممكن لزيادة نسبه الاشاره إل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور شينجي كاندا لإظهار التروية القلبية مع الحل المثبت في ميداكا ، السيدة لورديس كارو G تان للمساعدة في تربيه ميداكا ، والسيد أنتوني بلتيير للرسوم التوضيحية. تم تمويل هذا العمل من قبل NMBU ومجلس البحوث في النرويج ، ومنح عدد 248828 (برنامج الحياة الرقمية النرويج).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. . Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. Imaging blood vessels in the zebrafish. Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
