Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo
Summary
L’articolo descrive un protocollo rapido per l’etichettatura dei vasi sanguigni in un pesce teleostico da perfusione cardiaca di DiI diluito in fissativo, utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello e concentrandosi sul tessuto del cervello e dell’ipofisi.
Abstract
I vasi sanguigni innervano tutti i tessuti nei vertebrati, permettendo la loro sopravvivenza fornendo i nutrienti necessari, ossigeno, e segnali ormonali. È uno dei primi organi ad iniziare a funzionare durante lo sviluppo. I meccanismi di formazione dei vasi sanguigni sono diventati un argomento di alto interesse scientifico e clinico. Negli adulti, tuttavia, è difficile visualizzare la vascolarizzazione nella maggior parte degli animali viventi a causa della loro localizzazione in profondità all’interno di altri tessuti. Tuttavia, la visualizzazione dei vasi sanguigni rimane importante per diversi studi come l’endocrinologia e la neurobiologia. Mentre diverse linee transgeniche sono state sviluppate nel pesce zebra, con i vasi sanguigni visualizzati direttamente attraverso l’espressione delle proteine fluorescenti, non esistono strumenti simili per altre specie di teleostico. Utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello, il protocollo attuale presenta una tecnica rapida e diretta per etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell’ipofisi che irrora attraverso il cuore con fissativo contenente dii. Questo protocollo consente di migliorare la nostra comprensione su come le cellule cerebrali e ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.
Introduction
I vasi sanguigni giocano una parte essenziale del corpo dei vertebrati in quanto forniscono i nutrienti necessari, ossigeno e segnali ormonali a tutti gli organi. Inoltre, dal momento che la scoperta del loro coinvolgimento nello sviluppo del cancro1, hanno ricevuto molta attenzione nella ricerca clinica. Sebbene alcune pubblicazioni abbiano indagato sui meccanismi che consentono la crescita e la morfogenesi dei vasi sanguigni, e un gran numero di geni importanti per la loro formazione sono stati identificati2, molto resta da intendere per quanto riguarda l’interazione tra cellule o tessuti e il sangue circolante.
La visualizzazione della vasculatura del sangue nel cervello e nell’ipofisi è importante. I neuroni nel cervello richiedono un elevato apporto di ossigeno e glucosio3, e l’ipofisi contiene fino a otto importanti tipi di cellule che producono ormoni che utilizzano il flusso sanguigno per ricevere il segnale dal cervello e inviare i loro rispettivi ormoni a diversi organi periferici4,5. Mentre nei mammiferi, il sistema del portale alla base dell’ipotalamo chiamato l’eminenza mediana, collega il cervello e l’ipofisi6, tale ponte sanguigno chiaro non è stato descritto nel pesce teleostico. Infatti, nei teleosts, i neuroni preoptico-ipotalamici proiettano direttamente i loro assoni nel Pars nervosa dell’ipofisi7 e per lo più innervano i diversi tipi di cellule endocrine direttamente8,9. Tuttavia, alcuni di questi neuroni hanno le loro terminazioni nervose situate nello spazio extravascolare, in prossimità di capillari sanguigni10. Pertanto, la differenza tra il pesce teleostico e i mammiferi non è così chiara, e la relazione tra la vasculatura del sangue e le cellule del cervello e dell’ipofisi richiede una maggiore indagine nel pesce teleostico.
Il zebrafish ha, in molti aspetti, un sistema vascolare anatomicamente e funzionalmente paragonabile ad altre specie di vertebrati11. È diventato un potente modello di vertebrato per la ricerca cardiovascolare principalmente grazie allo sviluppo di diverse linee transgeniche dove i componenti del sistema vascolare sono etichettati con proteine reporter fluorescenti12. Tuttavia, l’anatomia esatta del sistema circolatorio può variare tra le specie, o anche tra due individui appartenenti alla stessa specie. Pertanto, la visualizzazione dei vasi sanguigni può essere di grande interesse anche in altre specie teleostico per le quali non esistono strumenti di transgenesi.
Diverse tecniche sono state descritte per etichettare i vasi sanguigni in entrambi i mammiferi e teleosts. Questi includono l’ibridazione in situ per i geni specifici della vasculatura, la colorazione della fosfatasi alcalina, la microangiografia e le iniezioni di colorante (per una recensione vedere13). Fluorescente lipofilico cationico indocarbocyanine Dye (dii) è stato utilizzato per la prima volta per studiare la mobilità laterale dei lipidi della membrana come viene mantenuto nei bilayer del lipido e può migrare attraverso di essa14,15,16. Infatti, una molecola di DiI è composta da due catene di idrocarburi e croofori. Mentre le catene di idrocarburi si integrano nella membrana a cellule a doppio strato lipidico delle cellule a contatto con esso, i croofori rimangono sulla sua superficie17. Una volta nella membrana, le molecole DiI diffondono lateralmente all’interno del doppio strato lipidico che aiuta a macchiare le strutture della membrana che non sono a diretto contatto con la soluzione DiI. Iniettare una soluzione DiI attraverso la perfusione cardiaca, quindi etichetterà tutte le cellule endoteliali a contatto con il composto permettendo l’etichettatura diretta dei vasi sanguigni. Oggi DiI è utilizzato anche per altri scopi di colorazione, come la singola molecola di imaging, la mappatura del destino, e traccia neuronale. È interessante notare che esistono diversi fluorofori (con diverse lunghezze d’onda di emissione) che consentono la combinazione con altre etichette fluorescenti, e l’incorporazione così come la diffusione laterale di DiI possono verificarsi in entrambi i tessuti dal vivo e fissi18, 19. la
La formaldeide, scoperta da Ferdinand Blum nel 1893, è stata utilizzata ampiamente fino ad oggi come la sostanza chimica preferita per la fissazione dei tessuti20,21. Mostra un’ampia specificità per la maggior parte degli obiettivi cellulari e conserva la struttura cellulare22,23. Conserva anche le proprietà fluorescenti della maggior parte dei fluorofori, e quindi può essere utilizzato per fissare gli animali transgenici per i quali le cellule bersaglio esprimono proteine reporter fluorescenti.
In questo manoscritto, un precedente protocollo sviluppato per etichettare i vasi sanguigni nei piccoli modelli sperimentali di mammiferi24 è stato adattato all’uso nei pesci. L’intera procedura richiede solo un paio di ore per eseguire. Esso dimostra come profumi una soluzione fissativa di formaldeide contenente dii nel cuore del pesce al fine di etichettare direttamente tutti i vasi sanguigni nel cervello e l’ipofisi del modello di pesce Medaka. Medaka è un piccolo pesce d’acqua dolce originario dell’Asia, che si trova principalmente in Giappone. Si tratta di un organismo modello di ricerca con una suite di strumenti molecolari e genetici disponibili25. Pertanto, l’identificazione dei vasi sanguigni in questa specie così come in altri permetterà di migliorare la nostra comprensione su come il cervello e le cellule ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusione cardiaca con DiI in precedenza è stata utilizzata per etichettare i vasi sanguigni in diverse specie di modello24, tra cui il pesce teleostico13.
Come DiI è direttamente consegnato alla membrana cellulare endoteliale per perfusione nella vasculatura, è possibile aumentare il rapporto segnale-rumore aumentando la concentrazione DiI nella soluzione fissativa. Inoltre, il fluoroforo fornisce una colorazione intensa quando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dr Shinji Kanda per la dimostrazione di perfusione cardiaca con soluzione fissativa in Medaka, Sig. ra Lourdes Carreon G Tan per l’aiuto con l’allevamento di Medaka, e il signor Anthony Peltier per le illustrazioni. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio di ricerca della Norvegia, Grant Number 248828 (programma Digital Life Norway).
Materials
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| borosilicate glass 10cm OD1.2mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| plastic petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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