In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Summary

Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.

Abstract

Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) machen einen großen Prozentsatz der Zellen in der Tumormasse für verschiedene Krebsarten aus. Glioblastom (GBM), ein bösartiger Hirntumor ohne Heilung, hat bis zu die Hälfte der Tumormasse TAMs. TAMs können pro-tumoral oder anti-tumoral sein, abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene in den Zellen. Genetische Mutationen in den Tumoren können durch die Regulierung der Zytokinexpression die Rekrutierung von TAMs in die Tumormikroumgebung beeinflussen. Hier beschreiben wir einen quantitativen zellbasierten Assay zur Beurteilung der Makrophagenrekrutierung durch das konditionierte Medium aus den Tumorzellen. Dieser Test verwendet die menschliche Makrophagen-Zelllinie MV-4-11, um die Makrophagen-Anziehung durch das konditionierte Medium aus dem Glioblastom zu untersuchen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und geringe Variabilität ermöglicht. Die mit diesem Test generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem Tumor und der Tumormikroumgebung beitragen. Ähnliche Assay kann verwendet werden, um Interaktion zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen zu bewerten, einschließlich T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) Zellen.

Introduction

Makrophagen sind Immunzellen mit hoher phäkotypischer und funktioneller Heterogenität¹. Sie spielen eine wichtige Rolle in den Wirtsabwehrsystemen, Gewebereparatur, Entwicklung und Tumorprogression¹. TAMs sind Makrophagen in der Mikroumgebung von soliden Tumoren. Bestimmte TAMs können das Tumorwachstum fördern, indem sie t zellvermittelte zytotoxische Aktivität hemmen, die Tumormikroumgebung (TME) modulieren, Angiogenese, Invasion und Metastasierung fördern^{2,3,4, 5}. TAMs gehören zu den häufigsten Zelltypen in der TME und eine höhere Anzahl von TAMs korreliert in der Regel mit schlechteren Patientenüberleben in vielen Arten von soliden Tumoren⁶. Die ausgeprägten genetischen Signaturen der Tumorzellen beeinflussen ihre Fähigkeit, Makrophagen zu rekrutieren. In GBM, einem aggressiven Hirntumor ohne Heilung, können Makrophagen bis zu der Hälfte der Tumormasse⁷ausmachen. Die Ko-Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seiner Abschneidemutung EGFRvIII wird häufig bei GBM beobachtet, was Tumorwachstumsvorteile⁸verleiht. Zellen, die EGFR und EGFRvIII mitexzieren, ziehen mehr Makrophagen an als Zellen, die EGFR oder EGFRvIII singly⁷exzieren.

Chemokine sind eine Familie von kleinen Zytokinen, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunzusammensetzung in der TME^6,9spielen. Menschliche Zellen exprimieren mehr als 50 Zytokine¹⁰. Die Immuninfiltration in den Tumoren wird weitgehend durch die Wechselwirkung zwischen Zytokinen und Zytokinrezeptoren¹¹realisiert. Jede Art von Immunzellen drückt unterschiedliche Chemokinrezeptoren/Chemokine aus und kann von Zellen rekrutiert werden, die bestimmte Chemokine/Chemokin-Rezeptoren sezernieren¹². Krebszellen können die Expression bestimmter Chemokine erhöhen, um Immunzellen wie TAMs, regulatorische T-Zellen und myeloiden-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) zu rekrutieren⁶. Die Blockade von spezifischem Chemokin, das von den Tumoren sezerniert wird, kann ein vielversprechender Weg sein, um die Infiltration von Immunzellen in die Tumormasse zu hemmen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine In-vitro-Evaluierung der Tumor-Makrophagen-Interaktion ermöglicht, indem konditionierte Medien aus den Tumorzellen verwendet werden, die Chemokine und Makrophagenzelllinien enthalten.

Protocol

1. Mittlere Vorbereitung Vorbereitung des serumfreien Stammzellmediums Die 50x B27-Ergänzung, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) und den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF, 20 g/ml in 10 mM Essigsäure mit 0,1% BSA) auftauen. Fügen Sie 500 l EGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 500 l FGF (Endkonzentration 20 ng/ml), 10 ml 50x B27 bis 500 ml Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) und 5 ml mit 100x Peni…

Representative Results

Die Ergebnisse werden in der Regel über Balkendiagramme angezeigt (Beispiel in Abbildung 1). Stichproben mit hohen 480/520-Werten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben. Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis ab…

Discussion

In diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte: 1) Auswahl der Transwell-Einfügung. Für die Zelllinie MV-4-11 funktionieren 5 m Transwell-Einsätze gut. Bei anderen Zelllinien, wie z. B. der häufig verwendeten Monozytenzelllinie THP-1, kann jedoch eine andere Porengröße besser funktionieren. 2) Da verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, ist es wichtig, die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellenzahlen anzupassen. Dazu können zellfreie Medien, die unter den gleich…

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021