Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans
Summary
Cette étude décrit des mesures quantitatives de la taille et de la localisation synaptiques, de la morphologie musculaire et de la forme mitochondriale chez C. elegans à l’aide d’outils de traitement d’image librement disponibles. Cette approche permet à des études futures chez C. elegans de comparer quantitativement l’étendue des changements structurels tissulaires et organllés résultant de mutations génétiques.
Abstract
Définir les mécanismes cellulaires sous-jacents à la maladie est essentiel pour le développement de nouvelles thérapies. Une stratégie fréquemment utilisée pour démêler ces mécanismes est d’introduire des mutations dans les gènes candidats et de décrire qualitativement les changements dans la morphologie des tissus et des organites cellulaires. Cependant, les descriptions qualitatives peuvent ne pas saisir les différences phénotypiques subtiles, peuvent dénaturer les variations phénotypiques entre les individus d’une population et sont souvent évaluées subjectivement. Ici, des approches quantitatives sont décrites pour étudier la morphologie des tissus et des organites dans le nématode Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie confocale de balayage laser combinée avec le logiciel de traitement de bio-image disponible dans le commerce. Une analyse quantitative des phénotypes affectant l’intégrité des synapses (niveaux de taille et de fluorescence intégrée), le développement musculaire (taille des cellules musculaires et longueur du filament de la myosine) et la morphologie mitochondriale (circularité et taille) a été effectuée pour comprendre les effets des mutations génétiques sur ces structures cellulaires. Ces approches quantitatives ne se limitent pas aux applications décrites ici, car elles pourraient facilement être utilisées pour évaluer quantitativement la morphologie d’autres tissus et organites dans le nématode, ainsi que dans d’autres organismes modèles.
Introduction
Le nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans) est de plus en plus utilisé comme un système modèle pour découvrir les processus biologiques et moléculaires impliqués dans les maladies humaines. Un nématode adulte a une longueur de corps d’un peu plus de 1 mm, et peut produire une grande couvée de jusqu’à 300 œufs1. Après l’éclosion, C. elegans ne nécessitent que 3-4 jours pour atteindre l’âge adulte, et vivent pendant environ 2 à 3 semaines2. En raison de sa facilité de culture, C. elegans est actuellement l’un des modèles animaux in vivo les plus recherchés pour effectuer un dépistage rapide et rentable des médicaments afin d’identifier les traitements pour les maladies humaines. En outre, sa conservation génétique, ses paradigmes comportementaux bien définis, son corps transparent pour la fluorescence ou la microscopie légère, et sa facilité de manipulation génétique rendent l’étude des conséquences cellulaires et moléculaires des mutations génétiques facilement réalisable 3. Le génome de C. elegans partage environ 60-80% d’orthologie avec des gènes humains, et environ 40% de ces gènes sont connus pour être liés à la maladie. Certaines des maladies humaines qui ont été modélisées et étudiées chez C. elegans comprennent les troubles neurodégénératifs (maladie d’Alzheimer, maladie de Parkinson, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth), les maladies musculaires associées ( Dystrophie musculaire de Duchenne), et les maladies métaboliques (hyperglycémie)2,4. Dans la plupart des désordres humains, la localisation cellulaire et organelle provoquée par la maladie et les changements morphologiques se produisent, qui peuvent facilement être évalués dans le modèle de nématode.
Les marqueurs fluorescents ont été largement utilisés pour étiqueter les tissus et les organites pour la visualisation dynamique au microscope. Cependant, chez C. elegans, les méthodes conventionnelles qui évaluent les irrégularités morphologiques dues aux mutations génétiques se sont largement appuyées sur des descriptions visuelles. Bien que les évaluations qualitatives puissent couvrir des gammes plus larges de descriptions phénotypiques (morphologie synaptique, agglutination du GFP, forme axonale spécifique, épaisseur des fibres musculaires, etc.) et fournir une vue d’ensemble des changements morphologiques, elles sont moins bien adaptées pour en comparant de petites variations entre les différents groupes. En outre, les évaluations qualitatives sont basées sur une évaluation visuelle et subjective, qui peut conduire à une surestimation ou à une sous-estimation des anomalies morphologiques. Enfin, les observations qualitatives peuvent également varier considérablement d’un individu à l’autre, ce qui crée des difficultés avec la réplication des données.
Ces dernières années, un certain nombre d’algorithmes de calcul faciles à utiliser et facilement disponibles qui peuvent analyser quantitativement les images ont été développés. Cependant, l’utilisation d’un tel logiciel d’analyse d’image pour certaines études morphologiques, en particulier en ce qui concerne les muscles de la paroi du corps et les mitochondries, dans la recherche C. elegans a pris du retard. Pour améliorer l’analyse structurelle sous-jacente chez C. elegans, certains des logiciels d’analyse d’images open source facilement disponibles ont été testés pour comparer quantitativement les effets des mutations génétiques sur les mitochondries musculaires, les muscles de la paroi du corps et les morphologie. Ces procédures expérimentales décrivent en détail comment ces programmes (Fidji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) peuvent être utilisés pour évaluer les changements dans la taille synaptique et la localisation des protéines synaptiques, la zone musculaire de la paroi du corps et la longueur des fibres, et la taille mitochondriale et circularité à la suite de mutations génétiques dans le nématode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les variations morphologiques ont souvent été évaluées par comptage manuel des différences notables ou en utilisant des seuils arbitraires pour déterminer les défauts par rapport à un phénotype de type sauvage. Plus récemment, cependant, des méthodes quantitatives ont été utilisées pour des études comparatives de la morphologie afin de mesurer et de décrire avec précision les changements au niveau cellulaire et subcellulaire d’une manière impartiale. La capacité d’identifier les différences subtiles m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Neumann pour leurs précieuses discussions et leurs commentaires. Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440). Les auteurs remercient WormBase pour sa richesse d’informations sur C. elegans, et reconnaissent Monash Micro Imaging, Monash University, pour la fourniture d’instrumentation, de formation et de soutien technique. Ces travaux ont été appuyés par des subventions de recherche de l’ACSM (2015 et 2018) et des subventions de projet 1101974 et 1099690 du CCRH à B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
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