Summary
ここでは、表現型および機能解析のための後部根神経節からマクロファージを迅速に分離するための機械的解離プロトコルを提示する。
Abstract
末梢神経損傷後の後の後の後の後の後の後の後部根神経節の免疫細胞と感覚ニューロン間の分子と細胞の相互作用を研究する関心が高まっています。マクロファージを含む末梢単球細胞は、有毒症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷に応答することが知られている。新たな証拠は、神経因性疼痛の発症および神経損傷の文脈における軸線修復に対する背中根神経節マクロファージの寄与に関与している。神経損傷の文脈における後部根神経神経マクロファージの反応を迅速に表現(または「急速に単離」)することは、未知の神経免疫因子を同定することが望まれている。ここでは、酵素フリーの機械的解離プロトコルを使用して、マクロファージを後部根神経節から迅速かつ効果的に分離する方法を示します。サンプルは細胞のストレスを制限するために全体を通して氷の上に保たれます。このプロトコルは、標準的な酵素プロトコルに比べてはるかに時間がかからず、蛍光活性化細胞選別分析に日常的に使用されています。
Introduction
免疫細胞が末梢神経損傷1、2に続く神経因性疼痛に寄与するというかなりの証拠がある。成熟マクロファージを含む末梢単球細胞は、有病動細胞症、抗原提示、およびサイトカイン放出を通じて組織損傷および全身感染に応答することが知られている。脊髄後角における神経損傷誘発ミクログリア活性化と並行して、後部根神経節(DRG)におけるマクロファージも神経損傷3,4後に有意に膨張する。特に、マクロファージがDRG5,6,7の感覚ニューロンと相互作用することにより末梢神経損傷後の神経因性疼痛発症に寄与するかどうかを判断する関心が高まっている。8,9,10歳,11.さらに、最近の研究はまた、神経損傷後の軸線修復におけるDRGマクロファージの寄与を含む12,13.別の研究はさらに、マクロファージ亜集団(すなわち、CD11b+Ly6ChiおよびCD11b+Ly6C低/-細胞)が機械的過敏症14において異なる役割を果たしうる可能性があることを示唆している。したがって、神経損傷の文脈におけるDRGマクロファージの応答を迅速に表現することは、神経因性疼痛に寄与する神経免疫因子を同定するのに役立つ可能性がある。
従来、DRG中のマクロファージを単離するプロトコルは、酵素消化15、16を含む複数のステップを含む。この手法は、多くの場合、時間がかかり、大規模な実験にはコストがかかる可能性があります。コラゲナーゼII型(4mg/mL)とジスパーゼ型II(4.7mg/mL)を20分間推奨していたが、この酵素に曝露した後の細胞は細胞損傷や細胞死に起こりやすく、低につながる可能性がある。収量。さらに、バッチからバッチへの酵素の品質の違いは、このプロセスの効率にさらに影響を与える可能性があります。さらに重要なことは、酵素消化にさらされたマクロファージは、望ましくない刺激を受ける可能性があるため、生体内状態とは大きく異なる可能性があります。この変更は、機能的研究の結果を複雑にする可能性があります。
ここでは、機械的解離を用いてDRGマクロファージを4°Cで迅速に単離する酵素フリープロトコルについて説明する。サンプルは細胞のストレスを制限するために氷の上に保たれます。その結果、我々のアプローチは、単離の一貫性を維持するための利点を提供し、単離された細胞は、おそらくより健康で、刺激が少ない。さらに、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析により単離細胞の品質を検証するエビデンスを提示する。
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Protocol
すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の機関動物ケア・使用委員会によって承認され、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに従って実施されました。
1. 実験マウスから腰椎DRGを採取する
- 実験を開始する前に、9巻の培地を1体のCa++/Mg++-free 10x HBSSと混合して密度勾配媒体(例えば、Percoll)の作業溶液を調製する。氷の上に置いておけ
- 2.5%アバーチンでマウスを麻酔する。後ろ足のピンチに対する応答の欠如によって動物が完全に麻酔されたことを確認します。
注:6〜8週齢の雄マウスと雌マウスの両方を用いた。 - 予熱した1x PBSの10 mLでマウスをトランスカルティブに浸透させます。
- マウスを化学ヒュームフードの中にテープで固定した4本の足で、マウスをサフィンの位置に置きます。鉗子によって肋骨ケージの下の皮膚を持ち上げ、肝臓および横隔膜を露出させるために外科はさみで小さい切開をする。
- 横隔膜と肋骨ケージを切るためにはさみを使い続け、胸膜腔を開けて心臓を露出させる。
- アイリスはさみで右心房の付属品を素早く切ります。出血が指摘されたら、左心室の後端に30Gの針を挿入し、ゆっくりと動物を浸透させるために予め冷やされた1x PBSの10 mLを注入する。
- 起こりやすい位置に置かれたマウス上で、後部ラミネクトミー15を行う。
注:細胞培養が計画されている場合は、切開前に70%のエタノールでマウスにスプレーし、解剖のために殺菌前の手術器具を使用してください。- サイズ11メスを使用して、胸部領域から仙骨領域まで始まる1つの縦方向の深部切開を行います。背中の筋肉層を露出させるにはさみで皮膚を取り除きます。
- フリードマン・ピアソン・ロンゲールを使用して、腰椎プロセスと両側横断プロセスが露出するまで、結合組織と筋肉を剥離します。
- Noyesスプリングシザーを使用して背部脊柱を慎重に開き、フリードマン・ピアソン・ロンゲールに切り替えて椎骨を取り除き、脊髄を損傷した脊髄を露出させる。
- 慎重にイプシラテラルおよび反対索腰部DRG(我々の研究ではL4/L5 DRG)を解剖し、氷冷Ca++/Mg++-フリー1x HBSSをダウン組織ホモジナイザーで1mLに入れます。これで、組織はステップ 2 の準備が整いました。
注:可能であれば、DRGに取り付けられた脊髄神経をトリミングします。
2. マウス腰椎DRGから単一細胞を分離する
- Dounceホモジナイザー20〜25回で緩い害虫でDRG組織を均質化します。
- 無菌の70 μmナイロン電池ストレーナーを無菌50 mL円錐管に入れます。800 μLの氷冷1x HBSSでセルストレーナーを濡らし、フロースルーを円錐管に集みます。
- ピペットを使用してホモジナイザーから均質化された組織懸濁液を収集し、50 mL円錐管に湿った70 μmナイロンセルストレーナーを通過します。
- ホモジナイザーを800 μLの氷冷1x HBSSで2回すすり、その後、セルストレーナーと同じ50 mL円錐管にデカントして収率を上げることができます。
- 無菌5 mLポリスチレンFACSチューブに平衡化された氷冷等対位密度勾配媒体(ステップ1.1で調製)の1.5 mLを追加します。
- 50 mL円錐管(ステップ2.4)から均質化したセルをFACSチューブに移し、上下にピペッティングして密度勾配媒体とよく混ぜます。上部をシールするために、1x HBSSの500 μLを追加します。
- 4°Cで20分間800xgで遠心分離によって細胞をペレットする。
- FACSチューブの底部の細胞ペレットを乱すことなく、培地中にミエリンを含む上清を慎重に吸引する。
- FACS分析のために5%の胎児ウシ血清(FBS)を含むPBSまたはFACSバッファー内の細胞を再中断する。
注: 1匹のマウスのL4 /L5 DRGからは、少なくとも50,000~100,000セルが期待されます。- 5%の胎児牛血清を含むPBSの100 μLで機械的に単離されたDRG細胞(L4/L5)を再中断し、1時間4°Cで暗闇の中でαマウスCX3CR1-APC抗体(1:2,000)でインキュベートします。
- 一度PBSの5 mLで細胞を洗浄します。4 °Cで8分間細胞360 x gを遠心分離します。
- 上清を吸引し、次いでFCAS分析のために300μLのPBSで細胞ペレットを再中断する。セルの並べ替えが計画されている場合は、代わりに FACS バッファー内のセルを再中断します。
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Representative Results
単離細胞を検証するために、まずマクロファージ・ファス誘発性アポトーシス(MAFIA)トランスジェニックマウス17を選択した。この線は、マクロファージとミクログリアの両方で特異的に発現されるCSF1受容体(CSF1R)のプロモーターの制御下で、薬物誘導性FK506結合タンパク質(FKBP)-Fas自殺融合遺伝子および緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現する。FK結合タンパク質ダイネライザーの全身注射、AP20187(AP)は、トランスジーンを発現する細胞のアポトーシスを誘導する。EGFPの発現はまた、DRG内のマクロファージを監視することを可能にする。MAFIAマウスのマクロファージを枯渇させるために、我々はAP(1 mg/kg)の毎日3回の食肉注射で研究を開始した。最後の注射後、DRGはGFPに対する免疫染色のために切除した。我々は、VEH処理マウスと比較してAP処理マウスのDRGにおけるGFP+細胞の有意な損失を記録した(図1A-B)。別の実験では、このプロトコルを使用して、治療後にDRGマクロファージを機械的に解離しました。その後のFACS解析では、AP処理マウス(図1C-D)におけるGFPハイ集団の枯渇に成功し、単離細胞の高品質を実証した。
また、野生型マウスから単離されたDRG細胞を特徴付けた。機械的に単離されたDRG細胞(L4/L5)をαマウスCX3CR1-APC抗体で染色した。DRG細胞の6%がCX3CR1+マクロファージ(図2A-B)であることが分かった。また、生存不可能な細胞の細胞内DNAに結合するヨウ化プロピジウム(2.5μg/mlの最終濃度)で細胞生存率を評価し、新たに単離されたDRG細胞の80%以上が生存可能であったことが明らかになった(図2C-D)。
図1:AP処理後のマフィアマウスのDRGにおけるマクロファージのFACS分析
MAFIAマウスは、分析の3日前にAP20187(AP)または車両(VEH)の1mg/kgの毎日の食後注射を受けた。(A, B)第3回AP処理後のL4/L5 DRGにおけるGFP+(緑色)マクロファージのAP誘導枯渇を示す代表的な免疫染色画像。NF200(青色)は、骨髄化ニューロンの標識に使用された。スケールバー:50μm。(C, D)L4/5 DRGの機械的解離後のCSF1R-GFPハイセルの割合はFACS分析により決定し、3つの独立した実験からの代表的なデータセットをゲート細胞集団のパーセンテージで示した。その結果、VEH処理動物のDRGから全単離された細胞の4%がGFPハイマクロファージであったことが示された。対照的に、AP処理マウスでは全DRG細胞のわずか0.4%がGFPハイマクロファージであった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:野生型マウスのDRGにおけるマクロファージのFACS特性特性図。
(A, B)ナイーブ野生型マウスのイプシラテラルL4及びL5 DRGを機械的解離のためにプールした。CX3CR1+マクロファージの割合は、FACS分析(A)によって測定した。CX3CR1+細胞のゲーティングは、APC結合アイソタイプコントロール抗体(B)でインキュベートした細胞における背景蛍光に基づいていた。(C, D)新たに単離されたDRG細胞の細胞生存率をヨウ化プロピジウム(PI)染色で評価した。PI+細胞(C)は、未染色細胞(D)における背景蛍光に基づいてゲートした。3つの独立した実験からの代表的なデータセットが示されたゲート細胞集団のパーセンテージで示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、マウスDRGから分離されたマクロファージを効果的に濃縮する新しい方法を紹介する。DRG免疫細胞を単離する従来のアプローチは、酵素消化15、18を必要とし、これは現在、望ましくない細胞損傷を制限し、収率を増加させるために、我々のプロトコルで機械的均質化に置き換えられています。したがって、新しいプロトコルは、はるかに少ない時間がかかります。さらに重要なことは、酵素消化がマクロファージを刺激し、分子シグネチャを変更する可能性があることです。対照的に、私たちの機械的アプローチは、細胞のストレスを大幅に制限します。
FACS解析を用いて、単離されたDRG細胞におけるマクロファージをさらに特徴付け、大きな細胞回収を実証した。このプロトコルの下で単離されたDRG細胞の80%以上が生存可能であることが判明した(図2D)。1匹のマウスのL4/L5 DRGからは、少なくとも50,000~100,000セルが期待されています。したがって、DRG細胞は、培養またはRNA単離のいずれかのためにマクロファージ亜母集団14にさらにソートすることができると確信できます。ただし、収量に影響を与える可能性のある重要な手順がいくつかあります。不満足な細胞収率が指摘されている場合、ステップ2.1における不十分または過剰な均質化が疑われるべきである。PI(図2)または7-AAD染色で評価された細胞死の程度は、プロトコルを最適化するために利用することができる。さらに、ステップ1.4のDRG解剖は、初心者のための繰り返し練習を必要とする場合があります。
現在、私たちの研究室では、主にDRGマクロファージの研究にこのプロトコルを使用しています。可能性が高い、このプロトコルの適用は、衛星細胞19、およびT細胞20などのDRG中の他の非ニューロン細胞を研究するために拡張することができる。細胞分離の有効性を確認するためにさらなる研究が必要である。残念ながら、我々の現在の機械的解離方法はDRG感覚ニューロンの単離には理想的ではなく、酵素消化は感覚ニューロン単離のための最も効果的な方法15のままである。
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Disclosures
著者は、この原稿に関連する競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
研究は、によってサポートされました: 麻酔教育研究のための財団 (XY);麻酔および周術的ケアのUCSF部門 (XY);1R01NS100801-01(GZ)を使用しています。本研究は、NIH(P30CA082103)の助成を通じて、HDFCCC細胞分析共有資源施設の一部を支援した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
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