Summary
Здесь мы представляем протокол механической диссоциации для быстрого изолировать макрофаги от кислого корневого ганглия для фенотипирования и функционального анализа.
Abstract
Есть растущие интересы для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий между иммунными клетками и сенсорными нейронами в корнях печени ганглиев после повреждения периферического нерва. Периферийные моноцитные клетки, в том числе макрофаги, как известно, реагируют на повреждение тканей с помощью фагоцитоза, антигена презентации, и цитокинов релиз. Новые данные причастны вклад дорсального корня ганглиев макрофагов к развитию нейропатической боли и аксонального ремонта в контексте травмы нерва. Быстро фенотипирования (или "быстрой изоляции") ответ на торсальные корня ганглиев макрофагов в контексте травмы нерва желательно определить неизвестные нейроиммунные факторы. Здесь мы демонстрируем, как наша лаборатория быстро и эффективно изолирует макрофаги от корня в сонто, используя протокол механической диссоциации без ферментов. Образцы хранятся на льду во всем, чтобы ограничить клеточный стресс. Этот протокол гораздо меньше времени по сравнению со стандартным ферментативным протоколом и регулярно используется для нашего анализа сортировки с плавающей с плавающей сортировки с флуоресценцией.
Introduction
Существует в настоящее время значительные доказательства того, что иммунные клетки способствуют невропатической боли после повреждения периферического нерва1,2. Периферических моноцитных клеток, в том числе зрелых макрофагов, как известно, реагировать на повреждения тканей и системной инфекции через фагоцитоз, антиген презентации, и цитокинов релиз. Параллельно нервной травмы индуцированной активации микроглии в спинномозговой рог, макрофаги в спинной корнегганглия (DRG) также значительно расширить после травмы нерва3,4. Примечательно, что есть растущие интересы, чтобы определить, если макрофаги способствуют развитию нейропатической боли после повреждения периферического нерва, взаимодействуя с сенсорными нейронами в DRG5,6,7, 8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11. Кроме того, последние исследования также связаны с вкладом DRG макрофагов в аксональный ремонт после повреждения нерва12,13. Другое исследование также предполагает, что макрофаг субпопуляции (т.е., CD11bиLy6Cпривет и CD11b-Ly6Cнизкий /- клетки) может играть иную роль в механической гиперчувствительности14. Таким образом, быстро фенотипирования ответ DRG макрофагов в контексте травмы нерва может помочь нам определить нейроиммунные факторы, способствующие нейропатической боли.
Условно, протокол для изоляции макрофагов в DRG включает в себя несколько шагов, включая ферментативное пищеварение15,16. Этот метод часто занимает много времени и может быть дорогостоящим для крупномасштабных экспериментов. Хотя мягкое пищеварение с коллагеназой II типа (4 мг/мл) и диспация II типа (4,7 мг/мл) в течение 20 мин было рекомендовано ранее15, можно предположить, что клетки после воздействия этого фермента склонны к повреждению клеток или смерти клеток, что может привести к низкой Урожайность. Кроме того, разница в качестве ферментов от партии к партии может еще больше повлиять на эффективность этого процесса. Что еще более важно, макрофаги подвергаются фермент пищеварения может быть нежелательно стимулировали и, таким образом, может быть очень отличается от статуса in-vivo. Изменения потенциально могут осложнить результаты функционального исследования.
Здесь мы описываем протокол без ферментов для быстрого изоляции макрофагов DRG при 4 градусах Цельсия с помощью механической диссоциации. Образцы хранятся на льду, чтобы ограничить клеточный стресс. В результате, наш подход обеспечивает преимущество для поддержания последовательности изоляции, и изолированные клетки, по-видимому, здоровее и менее стимулировали. Мы также представляем доказательства для проверки качества изолированных клеток с помощью анализа сортировки клеток fluorescence (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию при Калифорнийском университете в Сан-Франциско и проводились в соответствии с руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Сбор поясничного DRG от экспериментальных мышей
- Перед началом эксперимента подготовьте рабочее решение среды градиента плотности (например, Percoll), смешав 9 томов среды с 1 томомCa/Mg-free10x HBSS. Держите его на льду.
- Анестезия мыши с 2,5% Avertin. Подтвердите, что животное полностью обезглавлена из-за отсутствия реакции на щепотку задней лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как мужчины, так и женщины мышей в возрасте 6-8 недель были использованы. - Пронизыруй мышь транскардиально с 10 мл предварительно охлажденных 1x PBS.
- Поместите мышь в положение на спине с четырьмя лапами, закрепленными лентой внутри химического капота дыма. Поднимите кожу ниже грудной клетки щипками, и сделать небольшой разрез с хирургическими ножницами подвергать печени и диафрагмы.
- Продолжайте использовать ножницы, чтобы сократить диафрагму и грудную клетку, открыть плевральной полости, чтобы разоблачить бьющееся сердце.
- Быстро вырежьте правый предсердий придаток с ножницами радужной оболочки глаза. После того, как кровотечение отмечается, вставьте 30 G иглы в задней части левого желудочка, и медленно вводить 10 мл предварительно охлажденной 1x PBS, чтобы оперировать животное.
- Выполните дорсальную ламинэктомию15 на мышке, размещенной в положении лежа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура клеток планируется, распылить мышь с 70% этанола до разреза и использовать предварительно стерилизованные хирургические инструменты для вскрытия.- Используйте размер 11 скальпель, чтобы сделать один продольной боковой глубокие разрезы, начиная от грудной области до сакральной области. Удалите кожу ножницами, чтобы разоблачить слоем мышц.
- Используйте Фридман-Пирсон Rongeur, чтобы снять соединительной ткани и мышцы, пока светковые процессы позвоночника и двусторонних поперечных процессов подвергаются.
- Используйте Ножницы Noyes Spring, чтобы тщательно открыть спинной позвоночника, а затем переключиться на Фридман-Пирсон Rongeur удалить позвоночных костей подвергать спинного мозга с нетронутыми спинного нерва прилагается.
- Тщательно вскрыть ипсилатеральный и контралатеральный поясничный DRG (L4/L5 DRG в нашем исследовании) и поместить его в 1 мл ледяной Ca/Mg-бесплатно1x HBSS в Dounce ткани гомогенизатор. Теперь ткани готовы к шагу 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезать спинного нерва прилагается к DRG, если это возможно.
2. Изолировать одиночные клетки из поясничного DRG мыши
- Гомогенизировать ткань DRG с рыхлым пестиком в гомогенизаторе Dounce 20-25 раз.
- Поместите стерильный 70 мкм нейлоновой клетки ситечко в стерильной 50 мл конической трубки. Влажный ситечко с 800 л льда ледяной 1x HBSS, и поток через собирается в конической трубке.
- Соберите гомогенизированную суспензию ткани от гомогенизатора с помощью пипетки и пройти через мокрый 70 мкм нейлоновой клетки ситечко в 50 мл конической трубки.
- Промыть гомогенизатор дважды с 800 л ледяной 1x HBSS, а затем decant в той же 50 мл конической трубки с клеточной ситечко, чтобы увеличить выход.
- Добавьте 1,5 мл равновесной ледяной изотонной изотонной среды градиента плотности (подготовленной в шаге 1.1) в стерильную 5-мл полистирола FACS трубки.
- Перенесите гомегенат клетки из конической трубки 50 мл (на шаг 2.4) в трубку FACS, хорошо перемешайте с средой градиента плотности, прокладывая вверх и вниз. Добавьте дополнительные 500 л 1x HBSS, чтобы запечатать верхнюю часть.
- Пелле клетки центрифугации при 800 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно аспирируйте супернатант, содержащий миелин в среде, не нарушая клеточные гранулы в нижней части трубки FACS.
- Приостанавливаете действие клеток в буфере PBS или FACS, содержащем 5% сыворотки плода (FBS) для анализа FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере от 50000 до 100000 клеток, как ожидается, от L4 /L5 DRG одной мыши.- Приостановите механически изолированные клетки DRG (L4/L5) в 100 Л PbS, содержащих 5% сыворотки плода, а затем инкубировать с антителом CX3CR1-APC (1:2,000) в темноте при 4 кв КК на 1 ч.
- Вымойте клетки с 5 мл PBS один раз; центрифуги ячеек 360 х г в течение 8 мин при 4 градусах Цельсия.
- Аспирируйте супернатант, а затем повторно приостановите клеточные гранулы в 300 Л PBS для анализа FCAS. Если сортировка ячеек запланирована, приостановите работу ячеек в буфере FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проверки изолированных клеток, мы впервые выбрали Макрофаг Фас-индуцированных Апоптоз (MAFIA) трансгенных мышей17. Эта линия выражает наркотиков индуцируемого FK506-связывающего белка (FKBP)-Fas самоубийство синтеза гена и зеленого флуоресцентного белка (eGFP) под контролем промоутера рецептора CSF1 (CSF1R), который конкретно выражается как в макрофагах и микроглии. Системная инъекция FK-связывающего димеризатора белка, AP20187 (AP), индуцирует апоптоз клеток, выражающих трансген. Выражение EGFP также позволяет нам контролировать макрофаги в DRG. Чтобы истощить макрофаги у мышей MAFIA, мы начали наши исследования с 3 ежедневных интраперитонеальных инъекций АП (1 мг/кг). После последней инъекции, DRG были разделены для иммуно-пятно для GFP. Мы зафиксировали значительную потерю GFP- клеток в DRG обработанных AP мышей по сравнению с VEH обработанных мышей(Рисунок 1A-B). В отдельном эксперименте мы использовали этот протокол для механического диссоциации макрофагов DRG после лечения. Последующий анализ FACS показал успешное истощение GFPпривет населения в AP-обработанных мышей(Рисунок 1C-D) и продемонстрировали высокое качество изолированных клеток.
Мы также охарактеризовали изолированные клетки DRG от мышей дикого типа. Механически изолированные клетки DRG (L4/L5) были окрашены антителами CX3CR1-APC. Мы обнаружили, что 6% клеток DRG были cX3CR1и макрофагами(рисунок 2A-B). Жизнеспособность клеток была также оценена с Propidium Iodide (окончательная концентрация 2,5 мкг/мл), который связывается с внутриклеточной ДНК нежизнеспособных клеток, показывая, что более 80% свежеизолиловидных клеток DRG были жизнеспособными(Рисунок 2C-D).
Рисунок 1: FACS анализ макрофагов в DRG маминых мышей MAFIA после лечения AP.
Мыши MAFIA получали ежедневные интраперитонеальные инъекции 1 мг/кг AP20187 (AP) или транспортного средства (VEH) за 3 дня до анализа. (A, B) Представитель иммуно-спикеров изображений, показывающих AP-индуцированного истощенияGFP (зеленый) макрофагов в L4/L5 DRG после3-го лечения AP. NF200 (синий) был использован для обозначения миелинированных нейронов. Шкала бар: 50 мкм. (C, D) Процент csF1R-GFP hi-клеток после механической диссоциации L4/5 DRG был определен анализом FACS, и репрезентативный набор данных из трех независимых экспериментов показан с процентом закрытой популяции клеток показано. Результат показывает, что 4% от общего числа изолированных клеток из DRG VEH-обработанных животных были GFPпривет макрофаги. В отличие от этого, только 0,4% от общего числа клеток DRG были GFPпривет макрофаги в AP-обработанных мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: ХАРАКТЕРИСТИКа FACS макрофагов в DRG мышей дикого типа.
(A, B) Ipsilateral L4 и L5 DRG наивной мыши дикого типа были объединены для механической диссоциации. Процент макрофагов CX3CR1были измерены анализом FACS(A). Gating для CX3CR1- клетки были основаны на фоновой флуоресценции в клетках инкубированных с APC-конъюгированных изотипа контроля антитела(B). (C, D) Клеточная жизнеспособность свежеизолированных клеток DRG оценивалась с помощью окрашивания Propidium Iodide (PI). PIи клетки(C) были закрыты на основе фоновой флуоресценции в неокрашенных клетках(D). Отображается репрезентативный набор данных из трех независимых экспериментов с указанным процентом популяции закрытых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы вводим новый метод эффективного обогащения изолированных макрофагов от мыши DRG. Обычный подход к изоляции ИММУННых клеток DRG требует ферментативного пищеварения15,18, который в настоящее время заменяется механической гомогенизации в нашем протоколе, чтобы ограничить нежелательные повреждения клеток и увеличить урожайность. Таким образом, новый протокол гораздо меньше времени. Что еще более важно, пищеварение ферментов может стимулировать макрофаги и изменить молекулярную подпись. В отличие от этого, наш механический подход значительно ограничивает клеточный стресс.
Используя анализ FACS, мы также охарактеризовали макрофаги в изолированных клетках DRG и продемонстрировали большое восстановление клеток. Более 80% изолированных клеток DRG в соответствии с этим протоколом были признаны жизнеспособными(рисунок 2D). Ожидается, что от L4 /L5 DRG одной мыши от 50 000 до 100 000 ячеек. Таким образом, мы можем с уверенностью сделать вывод, что клетки DRG могут быть дополнительно сортированы в макрофаг субпопуляций14 для культуры или РНК изоляции. Тем не менее, есть несколько критических шагов, которые могут повлиять на урожайность. Если отметить неудовлетворительную урожайность клеток, следует заподозрить недостаточную или чрезмерную гомогенизацию в шаге 2.1. Степень клеточной смерти оценивается с PI(Рисунок 2) или 7-AAD окрашивания могут быть использованы для оптимизации протокола. Кроме того, вскрытие DRG в шаге 1.4 может потребовать повторной практики для начинающих.
В настоящее время наша лаборатория в основном использует этот протокол для изучения макрофагов DRG. Скорее всего, применение этого протокола может быть расширено для изучения других ненейрональных клеток в DRG, таких как спутниковые клетки19, и Т-клетки20. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эффективность клеточной изоляции. К сожалению, наш нынешний метод механической диссоциации не идеален для изоляции сенсорных нейронов DRG, а ферментативное пищеварение остается наиболее эффективным методом сенсорной нейронной изоляции15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах, связанных с этой рукописью.
Acknowledgments
Исследование было поддержано: Фонд омицации и исследований (XY); отделение анестезии и периоперационной помощи UCSF (XY); и 1R01NS100801-01 (ГЗ). Это исследование было частично поддержано Лабораторией анализа клеток ЛАБОРАТОРИей анализа клеток через грант от NIH (P30CA082103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| α-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
